石韦醇提物抑菌活性的初步研究

石韦醇提物抑菌活性的初步研究李雁群，黎桦，陈超君，覃锋，王爱勤，黄荣韶，林伟国【内容摘要】目的研究石韦地上部醇提物的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4个极性部位对大肠杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、黄曲霉、青霉、黑曲霉等8种常见菌的抑制造用。方法采取纸片扩散法进行抑菌试验，观察并测量抑菌环的大小。结果石韦醇提物的醋酸乙酯、正丁醇和水相萃取物对供试细菌均有不同水平的抑制造用。其中正丁醇相萃取物和水相萃取物的抑菌效果较好。石油醚相萃取物对这8种供试菌均无明显抑菌效果，各相萃取物对黄曲霉、青霉和黑曲霉也没明显抑菌效果。结论较强极性的提取物对5种细菌抑菌效果较为突出。【本文关键词语】石韦；极性部位；抑菌活性石韦pyrrosialingua〔thunb.〕farw.又名金茶匙、小叶石韦、象皮草、石茶、牛皮茶等，为水龙骨科多年生常绿附生草本蕨类，作为常用中药之一，石韦主治肾炎水肿、膀胱炎、泌尿系结石、肺性气管炎，哮喘、肺脓疡、咯血、吐血和尿血等［1］。我们国家石韦资源丰富，在广西境内分布较广，武鸣、藤县、金秀、桂平、梧州、资源和环江均有分布，重要生长在海拔100～1800m的石壁或树干上。据研究，石韦的重要药用成分是芒果苷〔具抗菌、抗单纯疱疹病毒〕、异芒果苷〔镇咳祛痰、抗单纯疱疹病毒作用〕、绿原酸〔抗菌、兴奋中枢神经等作用〕［2～4］，但有关石韦化学成分的抑菌性研究却很少，药用状态复杂，为深切进入开发这一丰富天然资源，本文对石韦地上部醇提物石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水不同极性溶剂得到的各部位提取物进行抑菌活性研究，以期探明石韦重要抑菌活性成分的极性部位和适宜的提取溶剂，并为石韦的合理开发提供根据。1仪器与材料1.1仪器与材料超净工作台、手提式灭菌锅、恒温控制箱、冰箱、游标卡尺、镊子、接种针、三角瓶等；石油醚、醋酸乙酯、乙醇、正丁醇等试剂均为分析纯。实验材料于200711采自广西武鸣大明山国家级水源林保卫区海拔1200m的沿路石壁上或乱石堆环境中，经广西大学植物分类学黎桦副教授鉴定为石韦p.lingua，将地上部洗净，天然风干后磨成粉末，过40目筛备用。1.2供试菌种供试细菌：大肠杆菌escherichiacoli，普通变形杆菌proteusvulgaris，金黄色葡萄球菌staphylococcusaureus，枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，藤黄八叠球菌sarcinalutea。供试真菌：黄曲霉aspergillusflavas，青霉penicilliumsp.，黑曲霉aspergillusniger。以上菌种均由广西大学农学院植物保卫系微生物学实验室提供。1.3培养基细菌用营养琼脂培养基培养，真菌用马铃薯培养基［5］培养。2方法2.1菌悬液或孢子悬液制备采取平板菌落计数法［5］。将受试菌在斜面培养基活化2～3代后，用接种环从斜面上刮菌苔两环，分别采集到内盛有100ml无菌水的250ml的三角瓶中，将受试菌配成终浓度0.1×107个/ml的菌悬液，备用。2.2样液制备石韦地上部醇提取物不同极性部位的制备：称取粉碎好的石韦样品4kg，用体积分数90%乙醇将样品浸泡3次〔料液比1∶15〕，每次7d，提取液在40°c下减压蒸馏，回收溶剂，得乙醇浸膏。将乙醇浸膏悬浮于蒸馏水，先后用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和蒸馏水萃取，分别得石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4部分萃取物，同前浓缩，即得各极性部位。2.3石韦抗菌作用的检测方法采取纸片扩散法进行抑菌试验［6］。在超净工作台上将灭菌后的牛肉蛋白胨培养基倒入培养皿中，每皿15ml，放置冷却。用无菌移液管取0.1ml细菌液加于平皿中均匀涂布于平板〔内径90mm〕外表后。取经灭菌的标准滤纸〔直径6mm〕，分别蘸取石韦醇提物的不同极性部位并贴于平板外表，每个培养皿放3片滤纸，以蒸馏水、石油醚为对照液。细菌于37℃培养24h、真菌于28℃培养48h后，检测抑菌环的有无并测量抑菌环直径，每种提取液对8种供试菌反复测定3次，结果取平均值。出现抑菌环的菌株才作mic检测。2.4最小抑菌质量浓度的检测采取纸片扩散法方法同“2.3〞，将各溶液稀释成100，50，25，12.5，6.25，3.125mg/ml的质量浓度梯度，以未见抑菌环的最高质量浓度为mic。3结果3.1不同极性部位的抑菌活性的比较对石韦地上部醇提物不同极性部位的抑菌活性进行比较,这4种溶剂极性大小为：石油醚＜醋酸乙酯＜正丁醇＜水。从表1能够看出，石韦醇提物的不同极性部位对5种细菌的影响作用不同，并存在一定的差别，而且同一极性部分对不同种细菌的抑制效果也不同。对5种细菌抑菌效果以极性较强的提取物较为突出，正丁醇相和水相对藤黄八叠球菌抑菌较强〔见表1〕，这可能是由于正丁醇相和水相含有活性较高的抑菌成分，化学成分较为多样且含量高。可见,石韦地上部醇提物不同极性部位抑菌活性因萃取溶剂不同、菌种不同而有所差别,这是由于不同极性提取物所含化学成分的类别和含量不同所致。这4部分对金黄色葡萄球菌均无明显抑菌作用，对大肠杆菌抑制造用较弱，而石油醚相对这5种供试菌均无明显抑菌作用。醋酸乙酯相对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有抑菌作用，正丁醇相对金黄色葡萄球菌也没明显抑菌作用。对照实验均无明显抑菌环，地上部醇提物不同极性部位对霉菌均无明显抑菌作用。表1石韦地上部醇提物不同极性部位对8种菌的抑制造用〔略〕3.2最小抑菌浓度比较由表2可知，石韦醇提取物不同极性部位对受试菌的抑菌效果显示量效关系。在低浓度时，无抑菌活性，抑制环基本上随药液质量浓度的增长而提升，抑菌活性渐显出来，由此可看出石韦提取物不同极性部位的最小抑菌浓度。只要正丁醇相对大肠杆菌有抑菌效果，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为50mg/ml。醋酸乙酯相、正丁醇相和蒸馏水相对普通变形杆菌的最小抑菌浓度分别为50，25mg/ml和12.5mg/ml，这三相对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为50，25mg/ml和12.5mg/ml，对八叠球菌最小抑菌浓度分别为25，25.00，12.5mg/ml〔见表3〕，可见，水相的最小抑菌质量浓度最小，其次是正丁醇。石韦地上部醇提物抗菌具有广谱性，对5种细菌均有不同水平的抑杀活性。表2醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸馏水相的抑菌环直径大小〔略〕表3醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸馏水相4种细菌的micmg·ml-1〔略〕4讨论本研究结果表示清楚，石韦醇提物4个极性部位的中强极性部位均含有抑菌活性物质，对5种细菌有一定的抑制造用。由于不同极性部位中化学成分有明显差别，不同细菌生长所需要的要素和代谢方式不同，所以其活性也有所差别。整体而言，正丁醇相和水相对普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌的抑制效果较好。这些细菌对人体致病力较强，如普通变形杆菌是泌尿系感染最常见的病原菌之一，这种感染具有持久性和难治性［7］。药用蕨类植物的重要活性成分包含生物碱、酚类和黄酮类［8］。石韦属植物含绿原酸、芒果苷、异芒果苷、β-谷甾醇、绵马三萜、槲皮素、异槲皮苷和三叶豆苷等［9］。从以上分析可知，石韦活性物质重要集中在中强极性部位，重要的抑菌活性成分存在于正丁醇极性部位和水部分，这可能与生物碱及其盐类、有机酸、萜类、黄酮及其苷类、甾体等抑菌活性物质有关［10］。绿原酸在高浓度时对大肠杆菌有明显的抑菌效用［11］。腹腔打针芒果苷,可明显降低糖尿病大鼠由于氧化性损伤引起的糖基化血红蛋白和血清肌酸磷酸激酶〔cpk〕的量［12］。应对抑菌效果好的醋酸乙酯相、正丁醇相和水相进行分离纯化，以便得到抑菌活性较高的化学成分，并对其抑菌作用方式、作用机理作进一步研究。石韦醇提物不同极性部位对黄曲霉、黑曲霉、青霉等霉菌无明显抑杀效应。石油醚相对这几种菌均没有明显抑菌效果，这与庄惠如等［6］研究发现蕨类醇提物的抗真菌活性不如抗细菌，殷帅文等［13］研究几种蕨类植物石油醚相抑菌效果相一致。各种供试药液对不同细菌的生长有不同抑制造用，以至没有抑制造用，说明石韦植物里面存在着不同溶解性的抑菌物质。以往多采取单种溶剂提取粗提物进行抑菌实验［14,15］，这种方法常由于有效成分含量太低或粗提物成分太杂而引起漏筛现象。本研究中，先采取乙醇提取，再浓缩，并用水、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水依次对提取物进行萃取，不仅使植物有效成分得到充足提取，避免漏筛，同时也为以后的活性成分分离鉴定奠定了基础。作为药用资源石韦具有较强的开发价值，但其抑菌活性详细成分尚不明确，因而，其抑菌活性值得研究。本实验为进一步研究不同溶剂提取物的详细化学成分打下基础，也为今后抑菌成分的进一步提取分离指明方向。【以下为参考文献】1］国家药典委员会.中国药典，ⅰ部［s］.北京:化工出版社,2000:68.［2］郑虎占,董泽宏,余靖.中药现代研究与应用，第2卷［m］.北京:学苑出版社,1998：1807.［3］包文芳.中国石韦属化学成分与分类学的研究［j］.沈阳药学院学报,1983，3:62.［4］郑民实,陆仲毅.芒果苷与异芒果苷的抗单纯疱疹病毒作用［j］.中国药理学报,1989,10(1):87.［5］范秀容,李广武,沈萍.微生物学实验［m］.北京:高等教育出版社,1996：151.［6］庄惠如,吴文珊,卢海声.福建福州25种蕨类植物抑菌活性挑选研究［j］.亚热带植物通讯,2000,29(1):7.［7］孙衡,熊自忠,曹红霞,等.临床分离变形杆菌的耐药性检测及分析［j］.安徽医药,2007,11(8):721.［8］周铜水.蕨类植物的黄酮类成分及其系统学意义［j］.武汉植物学研究,1989,7(4):388.［9］马辰,周圆,刘爱茹.高效液相色谱法测定中药石韦2种成分的含量［j］.药学学报，2003,38(4):288.［10］吴传万,杜小凤,徐建明,等.植物源抑菌活性成分研究新进展［j］.西北农业学报,2004,13(3):81.［11］康戈莉,尚树川,胡婉莹.微量热法研究金银花中绿原酸的抑菌性能［j］.山东师范大学学报(天然科学版),2008,23(1):85.［12］muruganandans,guptas.mangiferinprotectsthestreptozoto-cin-inducedoxidativedamagetocardiacandrenaltissuesi