基因工程的酶学基础1

基因工程的酶学基础1第1页/共103页

用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶第2页/共103页一、限制性核酸内切酶第一节限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）第3页/共103页2.性质内切酶。原核生物。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自我保护作用。3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源第4页/共103页限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）第5页/共103页细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基第6页/共103页DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。甲基化检测方法分为三类：基因组整体水平的甲基化检测基因特异位点甲基化的检测新甲基化位点的寻找。

第7页/共103页在人类基因组中,DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它与肿瘤的发生关系密切。

抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失与多种肿瘤的发生有关。第8页/共103页MeDIPSequencing（MethylatedDNAImmunoprecipitationSequencing）采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5‘-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后进行高通量测序。研究人员可以利用MeDIPSequencing快速有效地寻找基因组上的甲基化区域，从而比较不同细胞、组织、甚至疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。第9页/共103页第10页/共103页DpnIGATCCTAGCH3CH3(Chenetal.2013)Robustone-tubeΩ-PCRstrategyacceleratesprecisesequencemodificationofplasmidsforfunctionalgenomics第11页/共103页目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型I型限制性内切酶II型限制性内切酶III型限制性内切酶第12页/共103页首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoB和EcoK。是大型的多亚基蛋白复合物，由三种不同的亚基组成。既具有内切酶的活性，又具有甲基化酶的活性。1.I型限制性内切酶（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修饰的特异序列。第13页/共103页需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点第14页/共103页首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。2.II型限制性内切酶

分离的第一个酶是HindⅡ第15页/共103页EcoRI5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’

3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。第16页/共103页（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①

5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTC

CTTAAG5’--3’3’--5’CTTAA

GGAATTC5’--3’3’--5’第17页/共103页CTGCAG

②

3’端凸出（如PstI切点）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

GACGTC第18页/共103页

①连接便利（4）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。第19页/共103页第20页/共103页③补平成平齐末端②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。第21页/共103页识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①同序同切酶识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’

3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’

3’-TTCGAA-5’第22页/共103页XmaI5’-CCCGGG-3’

3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’

3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②同序异切酶③同功多位酶第23页/共103页识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第24页/共103页5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A第25页/共103页在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（7）Ⅱs型限制性内切酶移动切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNN

HgaICTGCGNNNNNNNNNN5’3’第26页/共103页3.III型限制性内切酶既具有内切酶的活性，又具有甲基化酶的活性，在特异的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG第27页/共103页核酸限制性内切酶的类型及主要特性主要特性I型内切酶II型内切酶III型内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG第28页/共103页切割位点距识别位点至少1kp处随机切割识别序列内或附近特异性切割距识别序列下游24-26bp处序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用途不大第29页/共103页获得序列未完全清楚的核酸的一种引物设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。简并引物(degenerateprimer)R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T,N=A/C/G/T

第30页/共103页1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。第31页/共103页2.

用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3.

如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。第32页/共103页DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度四、影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量③延长保温时间④扩大反应体积（>20l）一般采取第33页/共103页大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。？第34页/共103页不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.温度第35页/共103页是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)（1）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。第36页/共103页高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’。（2）星号（*）活性第37页/共103页

II型核酸内切酶的多酶联合酶切：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5‘

…GCTACATGGATCCCCCGGGTTCGCAT…3’3‘

…CGATGTACCTAGGGGGCCCAAGCGTA…5’5‘

…GCTACATG

GATCCCCCGGGTTCGCAT…3’

3‘

…CGATGTACCTAG

GGGGCCCAAGCGTA…5’5‘

…GCTACATGGATCCCCC

GGGTTCGCAT…3’3‘

…CGATGTACCTAGGGGG

CCCAAGCGTA…5’BamHISmaI第38页/共103页对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切

0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇

-20℃30分钟、高速冷冻离心15分钟、干燥第39页/共103页部分酶切应采取的措施：

完全酶切

限制酶识别序列为n个碱基，则其切割频率的理论值应是减少酶量缩短反应时间第40页/共103页物理作图:

限制性作图法（restrictionmapping）:是通过比较不同限制性酶产生的DNA片段的大小，将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置上，构建物理图谱的方法。EcoRIEcoRIEcoRIPstI

0.3kb1.1kb0.8kb2.0kb

第41页/共103页现要将一个目的基因克隆到表达载体上,目的基因通过设计基因特异的引物PCR扩增得到,如何设计酶切位点?(载体的多克隆位点有BamHI,HindIII)2.一长为4.2kb的DNA片段，分别用EcoRI、PstI及EcoRI+PstI消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱。作业:2.0kb0.8kb2.0kb1.9kb0.3kb2.8kb1.4kb1.1kb0.3kb第42页/共103页第二节DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。DNA复制一定有断口。第43页/共103页（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。二、DNAligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。第44页/共103页（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.连接条件第45页/共103页连接酶反应的最佳温度是37C。三、连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度所以一般采用4~16C。第46页/共103页增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1.插入片段与载体的浓度比例2.反应温度12.5℃。四、影响连接反应的因素3~10倍。一般14~16℃第47页/共103页从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。五、平头双链DNA片段的连接连接方法：（1）直接利用T4DNA连接酶进行连接。（2）先用末端核苷酸转移酶给平末端分子加上同聚物的尾巴之后，再用DNA连接酶进行连接。第48页/共103页加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM提高平头末端连接效率的方法包括：第49页/共103页第三节DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T4DNA聚合酶4.T7DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶第50页/共103页1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。第51页/共103页DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶I低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常用DNA聚合酶的特性比较第52页/共103页三、DNA聚合酶在基因工程中的用途

DNA聚合酶I(PolI)DNA聚合酶II(PolII)DNA聚合酶III(PolIII)参与DNA的修复参与DNA的复制1.大肠杆菌DNA聚合酶第53页/共103页大肠杆菌DNA聚合酶I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质①一条单链多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。第54页/共103页①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’—OH游离端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反应条件-OH5’3’dNTPs第55页/共103页①核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制备探针标记已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交第56页/共103页②DNA聚合酶I对探针序列的标记切口转移法(nicktranslation)：放射性同位素标记：DNA聚合酶I同时具备5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。第57页/共103页5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5’5’3’3’5’3’5’3’第58页/共103页纯化的DNA片断DNaseI制造单链切口DNAPolI进行切口转移一种-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记第59页/共103页2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性质DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶第60页/共103页①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途第61页/共103页3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h第62页/共103页③

cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物第63页/共103页（1）T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性第64页/共103页③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP互补的核苷酸的位置。第65页/共103页5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’第66页/共103页（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽末端②DNA3’末端标记第67页/共103页酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPs第68页/共103页4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。第69页/共103页（2）T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。②3’5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍第70页/共103页②进行末端标记①以大分子量DNA为模板的合成如M13③补平隐蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法标记3’末端。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。第71页/共103页5.修饰后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7DNA聚合酶的用途①DNA测序双脱氧法。②标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端第72页/共103页6.逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。（2）AMV的性质由和两条多肽链组成。第73页/共103页①链有反转录活性和RNaseH活性。RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNaseHRNADNARNADNA第74页/共103页（3）逆转录酶的用途②链RNA-DNA杂交双链中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA第75页/共103页可用随机引物（randomprimer）、基因特异性引物或oligodT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）②RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。第76页/共103页核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。其中专门水解断裂RNA分子的叫核糖核酸酶（RNase）,而特异水解断裂DNA分子的则叫脱氧核糖核酸酶（DNase）。一、核酸酶的基本定义第三节核酸酶第77页/共103页一类是从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫核酸外切酶（exonuclease）;

另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫核酸内切酶（endonuclease）。二、核酸酶分两种类型：第78页/共103页ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+1.核酸外切酶第79页/共103页双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）ExoIII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3'端外切第80页/共103页降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2+必需最适pH范围为4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）2.核酸内切酶第81页/共103页S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘

…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或

5‘NMPs第82页/共103页S1核酸酶的基本反应:内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA5‘

…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘

…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

5‘

…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘

…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘

nickgapS1Zn2+5‘

…G-C-T-C-A-G3‘

…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘

第83页/共103页S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNADNAmRNA杂交S1EcoRI第84页/共103页单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+第85页/共103页单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA环化ACHindIII第86页/共103页第五节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1.来源小牛胸腺。2.组成大小两个亚基。3.特性

5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）第87页/共103页②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端转移酶第88页/共103页4.末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源DNA载体DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶第89页/共103页（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow补平第90页/共103页AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA第91页/共103页AAGCTTTTTTCGA