第十章干细胞与细胞工程

第一节干细胞干细胞是指具有分裂增殖能力，并能分化形成一种以上“专业”细胞的原始细胞。—存在于胚胎的干细胞称胚胎干细胞—存在于成体细胞的干细胞称成体干细胞第一页，共20页。一、干细胞的形态与生化特征1、形态有共性，—通常为圆形或椭圆形，—细胞体积小，核相对较大，—核内多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性2、生化特性在干细胞表面可检测到早期胚胎细胞中表达的阶段特异性胚胎抗原（SSEA），SSEA有种属差异性。第二页，共20页。二、干细胞的增殖与分化特性1、干细胞的增殖特性—干细胞增殖的缓慢性：—干细胞增殖系统的自稳定性干细胞在生物体的生命过程中自我更新并维持自身数目恒定的特性称为干细胞的自稳定性。干细胞分裂后，如果两个子细胞都是分细胞或都是干细胞，称为对称分裂，若产生的子细胞一个是干细胞，一个是分化细胞，则称为不对称分裂。哺乳动物的干细胞是种群意义上的不对称分裂，称为种群不对称分裂。第三页，共20页。2、干细胞的分化特性1）干细胞的分化潜能-全能性干细胞-多能性干细胞-专能干细胞受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成一个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称为全能性。随着分化发育的进程，细胞逐渐丧失其分化潜能。从全能性到多能性，再到单能性，最后失去分化潜能成为成熟定型的细胞第四页，共20页。2）干细胞的转分化与去分化—干细胞的转分化：一种组织类型的干细胞在一定条件下可以分化为另一种组织类型的细胞—干细胞的去分化：一种干细胞向其前体细胞的逆向转化被称为是干细胞的去分化第五页，共20页。干细胞的特点①终生保持未分化或低分化特征；②在机体的中的数目、位置相对恒定；③具有自我更新能力；④能无限制的分裂增殖；⑤具有多向分化潜能，能分化成不同类型的组织细胞，造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等成体干细胞具有一定的跨系、甚至跨胚层分化的潜能；⑥分裂的慢周期性，绝大多数干细胞处于G0期⑦通过两种方式分裂，对称分裂和不对称分裂前者形成两个相同的干细胞或者分化细胞，后者形成一个干细胞和一个分化细胞。第六页，共20页。三、几种主要的干细胞1、胚胎干细胞（ESC）：是指来自胚胎期的卵裂球或胚泡的内细胞团，具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞胚胎干细胞在体外可无限增殖并保持未分化的状态，可以分化为外胚层、中胚层和内胚层各类型细胞，甚至可发育分化为一个完整的个体。全能细胞囊胚

胚胎内细胞团原始生殖细胞培养的胚胎干细胞第七页，共20页。胚胎干细胞的生物学特征1、体外分化抑制培养时，呈克隆状生长，细胞界限不清2、可在体外扩增、选择和冻存，需要时冻存细胞可解冻，继续培养而不失原细胞特征，3、细胞内散布着核糖体和线粒体，4、细胞核相对较大，核内多为常染色质5、表达阶段特异性胚胎抗原SSEA6、有很强的端粒酶活性。第八页，共20页。2、造血干细胞造血干细胞是存在于造血组织内的一类能分化产生各种血细胞的原始细胞，又称多能造血干细胞造血干细胞可分为两类：一类为长期造血干细胞，具有很强的自我更新能力，并维持长期的连续性；另一类为短期造血干细胞，具有有限的自我更新能力，维持正常造血细胞的生长；又称祖细胞或前体细胞。造血干细胞在成体血组织中数目很少，仅占有核细胞的0.05%,并且造血干细胞没有明显示的形态特征,只有通过其表面特有的标志分子和功能进行鉴定和分离纯化,CD34+是造血干细胞的代表性表面标志,临床和基础研究大多通过应用CD34+细筛选\富集造血干细胞。虽然CD34+细胞不全是造血干细胞，但造血干细胞全部表达CD34+分子。第九页，共20页。3、神经干细胞神经干细胞是指具有自我更新能力及分化形成神经元、支持营养神经元的星形胶质细胞和少突胶质细胞的一些细胞。

1992年开始，科学家分别从小鼠、大鼠和成人脑组织分离出神经干细胞；我国科学家从人胚胎纹状体、成年大鼠纹状体和小鼠胚胎质组织中获得神经干细胞；1996年，从成年哺乳动物脊髓内分离得到神经干细胞，由此提出神经干细胞在哺乳动物成体或胚胎中枢神经系统中广泛存在的观点。神经干细胞在形态上存在异质性，大多为梭形，两端有较长的神经突起，比较容易识别。神经干细胞的标志物有巢蛋白、波形蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白等。第十页，共20页。第二节细胞工程

细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学方法，在细胞水平上进行遗传操作、改变细胞的遗传学特征和生物学特性，以获得特定生物学特性细胞和生物个体的技术。常采用的生物技术有：细胞培养、细胞分化的定向诱导和显微注射等第十一页，共20页。一、细胞融合

细胞融合是两个或多个细胞合并形成一个细胞的过程。在自然情况下发生的融合称为自然融合，用人工方法促使细胞发生融合的，称为人工诱导融合常用的方法有：病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合法。主要过程如下：先两种不同类型细胞培养用灭活的仙台病毒或聚乙二醇与细胞混合继续培养在病毒作用下，两细胞融合对融合细胞筛选第十二页，共20页。二、杂交瘤与单克隆抗体单克隆抗体技术又称杂交瘤技术，主要由细胞融合、抗体筛选和细胞克隆化培养技术组成。正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。第十三页，共20页。单克隆抗体的主要应用1、作为医学检验试；如MHC和ABO血型鉴定等2、用于治疗疾病3、作为研究的探针，如用荧光物质标记单克隆抗体作为探针，确定相应生物大分子在细胞中的位置等。第十四页，共20页。三、干细胞工程干细胞工程是利用细胞培养技术在体外人工控制细胞分化、增殖并生长成所需要的组织，使之大量生产，用来修补损伤所引起的功能丧失的组织与器官，满足临床康复的需要，同时对一些一直困扰人类健康的疾病如恶性肿瘤、帕金森病等提供更好的医治。用干细胞治疗疾病的优点有：1、低毒性或开毒性，一次给药可长期有效；2、不需要完全了解疾病发病的确切机制；3、若应用自身干细胞移植，可避免产生排斥反应。第十五页，共20页。四、转基因动物转基因动物是应用分子生物学和实验动物胚胎学实验方法，将特定的目的基因从某一个体分离出来，在体外扩增加工，再导入另一种动物的是期胚胎或胚胎干细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在宿主动物的发良过程中表达，并通过生殖细胞传给后代而获得的具有外源基因的动物。常用方法有：显微注射法、DNA导入胚胎干细胞、核移植等第十六页，共20页。1、显微注射法用一个极细的玻璃针将外源DNA注射到受精卵雄原核中，待受精卵分裂后，将其移植到假孕母体输卵管或子宫内，胚胎便可正常发育为子代个体。优点：1）导入基因片段大，可达50kp2）不需载体3）整合率相对高缺点：1）难以控制整合率2）存活率低第十七页，共20页。2、DNA导入胚胎干细胞利用动物的胚胎干细胞作为外源基因的受体细胞，采用电激方法导入外源DNA优点：1）可直接将外源DNA整合到受体基因2）可研究和筛选外源DNA表达质粒的构建、整合和表达，以此来提高转基因动物的效率。3）可用于胚胎干细胞的基因改造技术，如剔除等能精确改造细胞内存在的基因。4）可不断提供和产生同样基因型的、丰富的转基因动物。

第十八页，共20页。3、核移植

指利用体外培养的体细胞，经外源基因转染后，取其细胞核注射到去核卵细胞中，从而获得转基因动物，如绵羊多莉的诞生：步骤一:：一只６岁芬兰多塞特白面母绵羊(姑且称为Ａ)的乳腺中取出乳腺细胞,将其放入低浓度的营养培养液中,细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞”；步骤二：从一头苏格兰黑面母绵羊（Ｂ）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去,留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”；步骤三：利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分