【课件】重组DNA技术的工具高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋子生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程❓技术目的研究水平诱变育种是_______(定向、不定向)的，基因工程育种是_____(定向、不定向)的。不定向定向1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。1967年发现，在细菌的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。1973年，证明质粒可以作为载体，构建重组DNA，并在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。为体外合成DNA提供了方便。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。1985年，穆里斯等人发明了PCR。1990年，人类基因组计划启动。2003年完成.21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。2013年，华人科学家张锋利用最新的基因组编辑技术对基因的定点插入、敲除或替换。

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭而导致产量大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，可抵御该病毒提高产量。要将抗病毒的外源基因导入番木瓜的细胞中，需要哪些“分子工具”？抗病毒基因重组DNA分子“切割”“拼接”番木瓜体细胞导入表达准确切割DNA分子的“分子手术刀”将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”限制酶DNA连接酶载体操作环境原理生物体外基因重组基本过程剪切→拼接→导入→表达为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？

①基因是控制生物性状的独立遗传单位②生物界共用一套遗传密码③遗传信息的传递都遵循中心法则3.1重组DNA技术的基本工具限制性内切核酸酶——“分子手术刀”来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗❓

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。限制性内切核酸酶——“分子手术刀”种类与命名：数千种一类酶粘质沙雷氏杆菌（Serratia

marcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）EcoRⅠ限制酶

SmaⅠ限制酶

限制性内切核酸酶——“分子手术刀”作用部位：特定切点上的磷酸二酯键磷酸二酯键5’ATGCTACG3’5’3’（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（2）在特定的位点切割DNA分子。作用特点：5'5'3'3'EcoRⅠ5'5'3'3'SamⅠ限制性内切核酸酶——“分子手术刀”识别序列特点：EcoRⅠ5’……G-A-A-T-T-C……3’3’……C-T-T-A-A-G……SamⅠ5’……C-C-C-G-G-G……3’3’……G-G-G-C-C-C……5’BamHⅠ5’……G-G-A-T-C-C……3’3’……C-C-T-A-G-G……5’TaqⅠ5’………T-C-G-A………3’3’………A-G-C-T………5’仔细观察左侧四种限制酶识别的特定序列有何特点？

呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。读：5’→3’限制性内切核酸酶——“分子手术刀”EcoRⅠ(在G与A之间切割)中轴线黏性末端平末端SamⅠ(在G与C之间切割)产生黏性末端或平末端切割结果：g1g2g3现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，如何操作？拓展思维需要有几个酶切位点？2产生几个末端？共产生几个磷酸基团？44使用EcoRⅠ酶剪切识别序列GAATTCg1g2g3CTTCATG

AATTCCCTAAGAAGTACTTAA

GGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG5‘5‘3‘3‘能切下目的基因且不破坏目的基因下图中，选择哪种限制酶来获得抗病基因（目的基因）？拓展思维选择限制酶切割目的基因的基本原则是：____________________________________________________。用同种限制酶切割(EcoRⅠ)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？

缺口怎么办？TGAATTCGACTTAAGCAGAATTCTTCTTAAGA拓展思维DNA连接酶——“分子缝合针”

将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。作用：作用部位：磷酸二脂键不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是____________________________________________________。DNA的基本组成单位、空间结构和碱基互补配对方式相同DNA连接酶——“分子缝合针”种类：①E.coliDNA连接酶②T4DNA连接酶从大肠杆菌中分离得到只能连接互补黏性末端的DNA片段从T4噬菌体中分离得到黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。平末端黏性末端GAATTCGATTCA

由于黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对形成氢键，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能，所以T4DNA连接酶黏性末端的连接速度比平末端的连接速度更快3.作用部位:磷酸二脂键DNA连接酶——“分子缝合针”DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNA聚合酶相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；

DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板。DNA连接酶提示：DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点不同点是否需要模板接DNA链作用过程作用结果用途作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成不需要需要双链单链在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子基因工程DNA复制DNA连接酶——“分子缝合针”总结归纳几种相关酶的比较名称作用部位作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链将两个DNA片段连接为一个DNA分子将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将DNA切成两个片段几种相关酶的比较作用底物作用部位作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶DNA水解酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA分子片段磷酸二酯键重组DNA分子脱氧核苷酸磷酸二酯键新的DNA分子DNA分子氢键单链DNADNA分子磷酸二酯键脱氧核苷酸基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.作用：将目的基因送入受体细胞

&在受体细胞内对目的基因进行大量复制2.最常用的载体——质粒质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。质粒基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”质粒载体需具备的条件——供外源DNA片段（目的基因）插入其中✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因④对受体细胞无害、易分离——便于重组DNA分子的筛选★思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？标记基因如何利用标记基因的筛选呢？普通培养基不含抗生素选择培养基50µg/ml四环素基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”【思考】：噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是

。病毒对宿主细胞的侵染具有一定的

性。利用病毒对宿主细胞的侵染性物种（组织）特异若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用

作为载体，其原因是

。噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕种类用途不同点质粒噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入细菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别种类：质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：手工制作：

重组DNA分子P731）每组一张蓝纸条、一张粉纸条：抄DNA序列。

粉纸条两端用透明胶纸粘成环（充当质粒）2）用剪刀将相关序列进行剪切3）用透明胶将目的基因与载体相连接。目的片段翻转过来，可以连接吗？目的片段可以自身环化吗？获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。为了产生相同的黏性末端，便于连接目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接但是使用该法缺点是容易发生

。为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。用两种限制酶分别对目的基因和载体切割用EcoRⅠ切下图含有“目的片段”的DNA分子，能成功不？…ATCGAATCATCCCGGGCATTAGTGCCAAGTCTCTGGAATTCACGATTAG……TAGCTTAGTAGGGCCCGTAATCACGGTTCAGAGACCTTAAGTGCTAATC……ATCGAATCATCCCGGGCATTAGTGCCAAGTCTCTGGAATTCACGATTAG……TAGCTTAGTAGGGCCCGTAATCACGGTTCAGAGACCTTAAGTGCTAATC…目的片段可以自身环化吗？目的片段和载体的末端相同吗？1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？

如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。

随着生物技术的飞速发展，生产和销售“分子工具”的公司大量涌现。感兴趣的话，你可以登录这些公司的网站，查询和了解相关产品的特点、价格和使用说明等。有些这样的公司已成功上市，你还可以通过分析公司的股票价格走势，大致了解公司的经营状况以及投资者目前对该行业的认可程度。

在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。1.“分子手术刀”——

1）来源：

2）作用：

3）作用结果：2.“分子缝合线”——

1）作用：

2）分类：3.“分子运输车”——

1）作用：

2）种类：

3）应具备条件：

限制酶

产生黏性末端、平末端

DNA连接酶将不同的DNA片段连接起来磷酸二酯键将外源基因送入受体细胞质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒E.ColiDNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）主要从原核生物中分离纯化出来。载体识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。作用部位：②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因④对受体细胞无害——便于重组DNA分子的筛选——供外源DNA片段（目的基因）插入其中DNA的粗提取与鉴定实验原理：

DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/LNaCl溶液。

在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。提取原理鉴定原理目的要求：①了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。②学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。选材：试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——破坏细胞，释放出细胞内的物质，溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用研磨液、二苯胺的配制方法-课本P117DNA的粗提取与鉴定材料用具：2.过滤取上清液3.DNA的析出4.DNA的鉴定1.研磨洋葱研磨液上清液上清液预冷的酒精白色丝状物二苯胺2mol/L的NaClDNA的粗提取与鉴定方法步骤：称取

，切碎，放入研钵，倒入

，充分研磨。在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取

。将丝状物或沉淀物溶于

溶液中，加入

试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。在上清液中加入体积相等的、

溶液,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。对照组：如何设置？阴性对照：在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。

（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合.含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。思考与讨论：如果是猪肝呢？鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？结果分析与评价：评价结果——看提取物颜色——看与二苯胺反应颜色的深浅DNA纯度

DNA的量2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法；对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果；如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等；看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。结果分析与评价：本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。

可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具