酶促反应动力学

第二章酶促反应动力学当前1页，总共106页。

第一节

酶催化反应的基本特征

酶是生物提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质是蛋白质。在生物体内，所有的反应均在酶的催化作用下完成，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密联系。生物酶分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。

当前2页，总共106页。酶催化反应和化学催化反应的转换数大小的比较

催化剂反应转换数mol/（中心点·S）温度℃酶催化剂菠萝蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶碳酸肝酶

肽的水解肽的水解肽的水解羰基化合物的可逆反应

4×10-3~5×10-18×10-2~1×103×10-3~1×1028×10-1~6×105

0~370~370~370~37化学催化剂硅胶－氧化铝硅胶－氧化铝二氧化钒二氧化钒异丙基苯裂解异丙基苯裂解环己烷脱氢环己烷脱氢

3×10-82×1047×10-111×102

2542025350当前3页，总共106页。酶活力表示方法酶的分子活力：在最适宜条件下，每1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol）酶的催化中心活力：在单位时间内，每一个酶的催化中心所催化底物的量（mol）酶活力：在特定条件下，每1min能催化1mol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，或称为国际单位，用U表示。酶活力还可用比活力表示。比活力系指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。当前4页，总共106页。绝对专一性：一种酶只能催化一种化合物进行一种反应

相对专一性：一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应

反应专一性：一种酶只能催化某化合物在热力学上可能进行的许多反应中的一种反应

底物专一性：一种酶只能催化一种底物

立体专一性：一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种

当前5页，总共106页。第二节均相的酶促反应动力学当前6页，总共106页。1.1.酶促反应的Michaelis-Menten方程1.1.1.酶促反应的Michaelis-Menten方程

Michaelis、Menten（1913）提出了单一底物的酶反应模型，基本内容是：酶E的底物S首先形成酶—底物复合物ES，在酶—底物复合物ES的基础上反应生成产物P和酶E。反应式如下：E+SES

E+Pk+1k+2k1当前7页，总共106页。其中：k+1，k1，k+2——反应速度常数

E，S，ES，P——酶，底物，酶-底物复合物，产物根据Michaelis、Menten的单一底物的酶反应模型，其假设条件为：（1）在反应过程中，限制反应速度的反应是ES到E+P这一步反应；（2）E+S到ES的反应在整个过程中始终处于动态平衡；（3）酶以酶游离状态E和酶-底物复合物ES的形式存在，酶在反应过程中总浓度不变；（4）底物浓度比酶-底物络合物浓度要大得多。当前8页，总共106页。根据反应的假设条件，可以看出Michaelis、Menten所建立的酶促反应模型式建立在平衡的基础之上的，因而称之为“平衡态理论”。当前9页，总共106页。根据假设（1），有单一底物的酶催化反应的反应速度：（1-1）式中：CP，CS——产物，底物的浓度

t——时间根据假设（2）有（1-2）当前10页，总共106页。即：（1-3）

式中：——酶—底物复合物的解离常数当前11页，总共106页。根据假设（3），有：总酶量：（1-4）联立（1-1）、（1-2）、（1-3）、有（1-5）式中：Vmax——最大的酶促反应速度。

（1-6）当前12页，总共106页。1.1.2Briggs-Haldane对M-M方程的修正

1925年Briggs和Haldane认为在酶促反应过程中，反应的中间体ES（酶-底物复合物）的浓度不随反应时间而变化，即在酶促反应过程中，反应的中间体ES的浓度处于稳定的状态，基于这一假设所得到的酶促反应的模型称之为“稳定态理论”。即（1-7）

当前13页，总共106页。则

（1-8）其中（1-9）称作M-M常数当前14页，总共106页。代入总酶量（1-4）得（1-10）将（1-10）式代入（1-1）式，有（1-11）当前15页，总共106页。1.1.3Michaelis-Menten方程的参数估计对特定的酶促反应，其动力学的M-M方程中的Vmax和Km是该酶促反应的特征参数。对Vmax和Km的确定的方法有Lineweaver-Burk法；Hanes-Woolf法；Eadie-Hofstee法；积分法等（1）Lineweaver-Burk法（简称L-B法）对M-M方程（1-11）式取倒数，得到（1-12）

当前16页，总共106页。

（2）Hanes-Woolf法（简称H-W法）对L-B法的（1-12）式的等式两端同乘CS，此种方法减少了CS值过大或过小所带来的测量误差。（1-13）

（3）Eadie-Hofstee法（简称E-H法）将M-M方程重排得到：（1-14）当前17页，总共106页。（4）积分法用不同的酶促反应的时间t与其反应过程相对应的底物浓度之间的函数关系通过作图或回归的方法确定酶促反应动力学参数。（1-15）当前18页，总共106页。例：在pH5.1、15℃下所测定的用葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度V0如表所示。求这一酶促反应的动力学参数Vmax和Km

。表1-1葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度与底物浓度CS（mmol/L）V0（mmol/L·min）5.550.1638.330.21111.110.24113.890.27616.660.30122.220.33927.770.347当前19页，总共106页。

解：采用Lineweaver-Burk法，对实验数据回归，有则

当前20页，总共106页。当前21页，总共106页。采用Hanes-Woolf法，对实验数据回归，有

则

当前22页，总共106页。当前23页，总共106页。采用Eadie-Hofstee法，对实验数据回归，有则

当前24页，总共106页。当前25页，总共106页。1.1.4酶促反应的反应级数（1）当CS远小于Km时，为一级反应（2）当CS远大于Km时，为零级反应。当前26页，总共106页。（3）当CS介于上述两者之间时，为0至1级反应当前27页，总共106页。1.2有抑制作用的酶促反应动力学1.2.1竞争性抑制的酶促反应动力学当反应物系中存在与底物的结构相似的物质，这一物质也可能与酶的活性部位结合，形成非活性的复合物，阻碍了酶与底物的结合，从而影响酶促反应，这种抑制作用称为竞争性抑制。当前28页，总共106页。竞争性抑制的机理为：其中：k+3，k+3—反应速度常数I，EI—抑制剂，酶-抑制剂复合物E+SES

E+Pk+1k+2k1E+IEIk+3k3当前29页，总共106页。基于稳定态理论，有（1-16）（1-17）总酶量为（1-18）当前30页，总共106页。联立（1-4）、（1-16）、（1-17）、（1-18）式，有（1-19）式中：KmI—竞争性抑制的表观M-M常数KI—抑制剂的解离常数

（1-20）

当前31页，总共106页。当前32页，总共106页。对有竞争性抑制的酶促反应动力学方程（1-19）式取倒数得到（1-21）当前33页，总共106页。当前34页，总共106页。1.2.2非竞争性抑制的酶促反应动力学当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合，且这一结合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用称为非竞争性抑制。与竞争性抑制相比较，当有非竞争性抑制剂时，无论如何提高底物的浓度也不会消除其抑制作用。

当前35页，总共106页。非竞争性抑制的作用机理为：E+SES

E+Pk+1k+2k1E+IEIk+3k3EI+SSEIk+4k4ES+ISEIk+5k5当前36页，总共106页。其中：k+4，k-4，k+5，k-5，—反应速度常数I，EI—抑制剂，酶-抑制剂复合物IES—底物、酶-抑制剂三元复合物基于稳定态理论，有（1-22）总酶量为

（1-23）当前37页，总共106页。有非竞争性抑制的酶促反应动力学方程（1-24）当前38页，总共106页。当前39页，总共106页。当前40页，总共106页。1.2.3反竞争性抑制动力学反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物[Es]相结合生成[SEI]复合物。当前41页，总共106页。当前42页，总共106页。当前43页，总共106页。当前44页，总共106页。当前45页，总共106页。当前46页，总共106页。抑制百分数i:

表示抑制剂对酶催化反应的抑制程度。

i值愈大，表示抑制的程度愈大；i值愈小，抑制程度愈小。0≤i≤1。当前47页，总共106页。当前48页，总共106页。1.2.4高浓度底物抑制作用的酶促反应动力学应用稳态理论，可得到底物抑制的酶促反应动力学方程为（1-25）E+SES

E+Pk+1k+2k1ES+SSESk+3k3当前49页，总共106页。根据即当前50页，总共106页。解得：最佳底物浓度：当前51页，总共106页。当前52页，总共106页。例：在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为2.2×10-1mmol／L的抑制剂，并测其初始的反应速率，其数据见下表。当前53页，总共106页。解以L—B作图法来判断抑制类型并求其参数。据此上述实验数据分别取其例数，以l／rSI对1／Cs做图，得到如图所示两条直线，它们在纵轴有一共点交点，这表明该抑制为竞争性抑制。当前54页，总共106页。当前55页，总共106页。当前56页，总共106页。1.2.5复杂的酶催化反应动力学一、可逆酶反应动力学Kmp和Km分别为正、逆反应米氏常数；rP,maxrs,max分别为正逆反应的最大速率当前57页，总共106页。反应的净速率式

若令：

式中Ke一一反应平衡常数

当前58页，总共106页。二、产物抑制的酶反应动力学产物抑制系指当产物与酶形成复合物EP后，就停止继续进行反应的情况，特别是当产物浓度较高时有可能出现这种抑制。其反应机理所生成EP为无活性的端点复合物应用稳态法推导得出如下反应速率方程式当前59页，总共106页。三、多底物酶反应动力学（1）随机机制两个底物S1和S2随机地与酶结合，产物P1和P2也随机地释放出来。

其机理可表示为

当前60页，总共106页。式中:Cs1和Cs2分别为底物sl与s2的浓度，K1、K3、K4分别为相应各步的解离常数

当前61页，总共106页。（2）顺序机制两个底物Sl和s2与酶结合成复合物是有顺序的，酶先与底物s1结合形成〔Es1〕复合物，然后该复合物Esl再与s2结合形成具有催化活性的[ES1S2]。按同样推导方法求出下述方程式：式中:Cs1和Cs2分别为底物sl与s2的浓度，K1、K3、K4分别为相应各步的解离常数。

当前62页，总共106页。（3）乒乓机制

与始终不同时与酶结合，其机理可表示为（为修改过的酶）：导得：(2.38)当前63页，总共106页。

四、变构酶催化反应动力学如磷酸果糖激酶，天冬氨酸转氨甲酰酶，苏氨酸脱氢酶和己糖激酶等的催化反应，底物分子与这类酶结合时能诱导酶的结构改变增加E与S的结合能力，表现出底物对酶的激活效应。其机理复杂提出的模型较多，一般用Hill经验公式：(2.39)式中：n—Hill指数表示每个酶分子与底物结合部位的数目，n=1~3.2参数求取：(2.40)当前64页，总共106页。与式(2.39),(2.40)相应的曲线见图2.15,图2.16。（还有常用的表达式：等）图2.15Hill经验方程图2.16变构酶动力学参数当前65页，总共106页。1.2.6.影响酶催化反应的因素内部因素——酶的结构特征，底物的结构特征。外部因素——pH,t,p,离子强度，……（1）pH值的影响酶分子上AA侧链基团一定的解离状态及其解离度（催化活性）一般酶活性与pH呈钟型曲线为图2.9当前66页，总共106页。4812图2.9某酶的稳定性与活性PH-rs相对值当前67页，总共106页。（2）温度的影响T<Topt则其对酶促反应的速度常数K+2的影响符合Arr.eq:K+2=A.exp(-Ea/RT)(2.41)当前68页，总共106页。第三节

固定化酶催化反应动力学当前69页，总共106页。3.1固定化酶的性质不同于原游离酶性质的原因是：①在酶的固定化过程中产生的；②实际使用中由于传递阻力等的变化引起的。要预测固定化酶反应进行中的实际状态，就必须了解固定化酶反应动力学特征及其相关参数与反应速率关系。当前70页，总共106页。以微胶囊包埋法固定化酶促反应(图2—5)为例，其反应历程由如下5步组成：①底物由主体溶液传递到固定化酶载体的外表面；②底物由外表面向载体内扩散；③进行酶促反应；④产物由内部扩散到载体外表面；⑤产物传递到主体溶液。当酶固定化于载体的外表面时，没有②和④两个阶段。可以看出，固定化酶的催化反应受到了物质传递和酶促反应两个方面的影响。当前71页，总共106页。3.2影响固定化酶促反应的主要因素(1)分子构象的改变酶分子构象的改变(图2—6)是指固定化过程中酶和载体的相互作用引起酶的活性中心或调节中心的构象发生了变化，导致酶与底物的结合活力下降的一种效应。这种效应多出现于吸附法和共价偶联法的固定化酶中，难以定量描述与预测。当前72页，总共106页。当前73页，总共106页。(2)位阻效应位阻效应(图2—6)是载体的遮蔽作用(如载体的空隙太小，或者固定化位置或方法不当，给酶的活性中心或调节中心造成空间障碍，使底物和效应物无法与酶接触等)引起的。选择适宜的载体与固定化方法，可消除这种不利因素的影响，但这种效应难以定量描述。当前74页，总共106页。(3)微扰效应由于载体的亲水性、疏水性及介质的介电常数等，使紧邻固定化酶的环境区域(微环境，图2—7)发生变化，改变了酶的催化能力及酶对效应物做出调节反应的能力。这种效应难以定量描述和预见，但可以通过改变载体与介质的性质而做出判断与调节。当前75页，总共106页。(4)分配效应分配效应是由于固定化载体与底物或效应物之间的疏水性、亲水性及静电作用所引起微环境(固定化酶紧邻的微观局部环境)和宏观环境之间物质的不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速率的一种效应。当前76页，总共106页。(4)分配效应分配效应可以通过分配系数KP，来定量描述，KP的定义是载体内外底物(或其他物质)浓度之比。底物的KP可通过如下方法测定：在已知浓度和体积的底物溶液中，放人不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液中的底物浓度。当前77页，总共106页。(5)扩散限制扩散限制是指底物、产物及其他效应物的迁移和传递速度所受到的一种限制。一般水溶液及凝胶中的物质扩散系数很低，当酶的催化活性很高时，在固定化酶的周围形成浓度梯度，造成微环境和宏观环境之间底物和产物的浓度有差别。当前78页，总共106页。(5)扩散限制扩散限制的大小可通过引入相应的参数进行定量分析。作为一般规律，如果酶的催化反应速率很小，扩散限制的影响小或没有，此时的酶促反应阶段成为整个反应的限速阶段。当前79页，总共106页。3.3固定化酶反应动力学固定化酶催化反应中的反应速率是通过测定宏观环境中底物和产物的浓度而获得的，它代表所有局部速率总和的平均值。反应总速率与宏观环境中相关浓度的关系，不同于其与微环境中相关浓度的关系。反应总速率为多种因素所影响，如果不能准确把握反应总速率与底物或产物在固定化酶颗粒内外的传递特性，就不可能得到正确的反应动力学方程。当前80页，总共106页。3.4固定化酶促反应中的过程分析固定化酶促反应过程中，需考虑扩散传质与催化反应的相互影响，注意外部与内部扩散的不同传质方式。内部扩散与催化反应有时是同时进行的，两者相互影响。外扩散通常先于反应。在分析固定化酶的反应与外部或内部物质传递之间的相互关系时，采用的数学方法不同。为简化起见，在讨论外部扩散时，忽略固定化酶颗粒内部的扩散问题；讨论内部扩散时，假定固定化酶颗粒外部传质阻力小，颗粒外表面处的底物浓度与主体溶液中底物浓度相等。当前81页，总共106页。3.4.1.外部扩散过程底物由液体主体向固定化酶颗粒表面的扩散速率N，正比于传质表面积及传质推动力，即当前82页，总共106页。当前83页，总共106页。当前84页，总共106页。当前85页，总共106页。3.4.2.内部扩散过程对具有大量内孔的球形固定化酶颗粒，其内部是酶促反应的主要场所。底物通过孔口向内扩散，达到不同深度，产物沿反方向从内部向孔口外扩散。颗粒内部各处底物和产物的浓度不同，导致各处的反应速率和选择性的差异。这就是说，在同当前86页，总共106页。3.4.2.内部扩散过程在同样的主体浓度下，内部各处是不等效的，这就提出了内部传递