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图位克隆的基本原理和方法第1页,共20页,2023年,2月20日,星期四图位克隆的基本原理其基本的原理是:功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座,通过找到与目标性状紧密连锁的分子标记,在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上,由于水稻全基因组序列的发布,我们可以得到已定位区段的候选基因,通过对候选基因进行分析,确定目标基因,最后经遗传转化试验证实目的基因功能。第2页,共20页,2023年,2月20日,星期四图位克隆的步骤:PrimarymappingFinemappingCandidategeneComplementationtestFunctionalanalysis第3页,共20页,2023年,2月20日,星期四PrimarymappingTraitmethodMappingpopulationQualitativetraitsbulkedsegregmentanalysisF2、BC1Quantitativetraitswhole-genomeQTLscreenRIL、DH、NILprimarymappingmethodandMappingpopulation
第4页,共20页,2023年,2月20日,星期四作图群体将纯合突变体与ZS97进行杂交,对杂交的种子进行基因型鉴定,找到杂合型种子(即种子能够发生分离),将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。第5页,共20页,2023年,2月20日,星期四R/Rr/rR/R
R/rF2
×
R/r
r/rF1
P1
纯合突变体P2ZS97
第6页,共20页,2023年,2月20日,星期四primarymappingmethodBulkedSegregmentAnalysis:群组分离分析法。原理是将分离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、感病)分成两组,每一组取样8-15份,在每一组群体中将各个体DNA等量(等浓度等体积)混合,形成两个DNA池(如抗病池和感病池)。同时需要构建两个亲本(ZH11/ZS97)的BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择,因此两个池间理论上就应主要在目标基因区段存在差异。第7页,共20页,2023年,2月20日,星期四ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)HY1(W)HY1(M)HY2(W)HY2(M)HY3(W)HY3(M)HY5(W)HY5(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标记进行PCR扩增,经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。第8页,共20页,2023年,2月20日,星期四找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测:即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体,将找到的分子标记分别扩增这些样,看表型与基因型是否对应。同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。第9页,共20页,2023年,2月20日,星期四Finemapping一.表型观察二.筛选交换单株三.开发新的分子标记第10页,共20页,2023年,2月20日,星期四R/Rr/rR/R
R/rF2
×
R/r
r/rF1
P1
纯合突变体P2ZS97
正常表型突变表型第11页,共20页,2023年,2月20日,星期四ZH11:“A”ZS97:“B”交换有两种带型:H和B第12页,共20页,2023年,2月20日,星期四单株12345678910M1M2M3M4M5
HAAB
HAAAAB
HAABAAAAAAAAAAAAAAAAAHAAAB
HHAAAHHAAB
B
H
BA基因和表型相对应!第13页,共20页,2023年,2月20日,星期四开发新的标记:新的SSR标记:
/modules/redbtools/ssrscan.php,运行SSRScan就会得到该段序列的简单重复序列。InDel/Caps标记:将要开发标记的日本晴区段序列与93-11做一个blast,选取插入或者缺失比较大的位点设计引物。SNPS标记:可以通过测序找到在ZH11/ZS97间存在单碱基差异的位点,或者找谢老师咨询。第14页,共20页,2023年,2月20日,星期四Candidategene将最后精细定位区段在/cgi-bin/gbrowse/rice/中输入定位区间的物理位置,即可显示出候选基因。第15页,共20页,2023年,2月20日,星期四第16页,共20页,2023年,2月20日,星期四精细定位扩大群体,进行精细定位第17页,共20页,2023年,2月20日,星期四找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因,可以通过比较扩增,测序,表达量检测及
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