中药分子检测解决方案

主要内容中药材分子检方法介绍目标客户及客户工作中的主要困难耶拿公司的相关高效整体解决方案中药分子检测对AJ销售的重要意义1第一页，共48页。中药材分子鉴定方法介绍第二页，共48页。中药材鉴定的主要内容鉴定目的：保证用药的安全性和有效性3鉴定内容真伪鉴定纯度鉴定品质优良度鉴定中药材：包括药材、药材粉末、部分药材饮片第三页，共48页。中药材鉴定的主要内容鉴定目的：保证用药的安全性和有效性4鉴定内容真伪鉴定纯度鉴定品质优良度鉴定重点、难点第四页，共48页。四大传统经典的鉴定方法

一、原植物（原动物）基原鉴定：是中药基原鉴定的基础，观察其形态特征，应用植（动）物分类学的知识进行鉴定局限性：直接用于中药材及其饮片的鉴别有一定难度，因为形态易有较大变化5第五页，共48页。四大传统经典的鉴定方法

二、性状鉴定：利用人体的感觉器官（眼观、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等）去观察性状，进行鉴定局限性：可以确定部分中药的基原品种，但难以区别开大部分来自近缘物种的中药材和中药饮片6第六页，共48页。四大传统经典的鉴定方法

三、显微鉴定：利用显微镜对药材或成方制剂的组织、细胞或内含物进行鉴别局限性：可以确定部分中药的基原品种，但难以区别开大部分来自近缘物种的中药材和中药饮片7第七页，共48页。四大传统经典的鉴定方法

四、理化鉴定：利用物理或化学的方法对药材和制剂进行定性和定量的分析（色谱、紫外、红外、质谱、核磁共振等）局限性：因中药活性成分的含量受到其生长条件、采收时间、贮藏等因素的影响而发生变化，容易影响鉴定结果的准确性，同时亲缘关系较近的物种化学成分相似而难以区分8第八页，共48页。中药材的分子鉴定法应运而生正如法医领域的犯罪嫌疑人鉴定、亲子鉴定等，采用的就是基于DNA的分子鉴定法A、T、G、C四种核苷酸组成的基因序列每个人种都有自己特定的基因每个人都有自己特定的基因利用DNA分子鉴定的方法，可以最准确、最科学地得到真伪鉴定结果9第九页，共48页。中国药典在中药材分子鉴定相关内容的发展2010版《中国药典》收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片、川贝母药材的DNA分子鉴定方法2015版《中国药典》收载了“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”，标志着中药材的分子鉴定从实验室科研层面进入国家标准的应用层面10第十页，共48页。中药材分子鉴定方法——聚合酶链式反应法（PCR法）取样及样品处理DNA提取PCR扩增电泳分离凝胶成像判定结果11第一步第二步第三步核酸质控第十一页，共48页。以2015中国药典中的乌梢蛇饮片为例：12聚合酶链式反应法——PCR第一步：DNA提取第十二页，共48页。以2015中国药典中的乌梢蛇饮片为例：13聚合酶链式反应法PCR：在体外将某一DNA片段（目的基因）扩增，以获得大量的目的DNA片段1—2—4—8—16—32—64—128--------2n指数扩增一般PCR反应运行30个循环，即可得到几百万条目的DNA片段第二步：PCR反应第十三页，共48页。以2015中国药典中的乌梢蛇饮片为例：14聚合酶链式反应法第三步：电泳检测（含电泳分离和凝胶成像条带分析）结论：样品是乌梢蛇第十四页，共48页。川贝母蕲蛇15第十五页，共48页。2015中国药典中另一种分子鉴定方法：

中药材DNA条形码分子鉴定

由中国中医科学院中药研究所所长陈士林院士为主开发制定主要的核心也是PCR方法，区别：下游改用测序的方法，比对数据库序列来鉴定16取样及样品处理DNA提取PCR扩增电泳分离凝胶成像回收片段测序数据库序列比对得到鉴定结果测序鉴定第十六页，共48页。中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则介绍中药材DNA条形码分子鉴定法，就是通过分子生物学的方法测定中药材基因组上一段标准的、具有足够变异的特有的DNA

序列，来实现物种鉴定。指导原则中，以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA-trnH为辅助序列动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列ITS2：核糖体DNA中内部转录间隔区2psbA-trnH：叶绿体上去除psbA基因及trnH基因的基因间隔区序列COI：线粒体上细胞色素C氧化酶辅酶I以上基因片段通常是几百bp，都具有多态性，常用于物种鉴定17核心：PCR法第十七页，共48页。实验设计：ITS2片段扩增：正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH片段扩增正向引物：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。COI序列扩增正向引物HCO2198：5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；反向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。18第十八页，共48页。PCR反应体系配置：PCR反应体系以25μL为参照：PCRBuffer（10×）2.5μLMgCl22μL（25mmol/L）dNTPs混合物2μL（2.5mmol/L）上游和下游引物各1.0μL（2.5μmol/L）TaqDNA聚合酶1.0U模板DNA1μL加无菌双蒸水至25μL应设置未加模板DNA的阴性对照。19第十九页，共48页。PCR反应程序：ITS2序列扩增程序：94℃，变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸10min。psbA-trnH序列扩增程序：94℃变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸7min。COI序列扩增程序：94℃1min；94℃1min，45℃1.5min，72℃1.5min，5个循环；94℃1min，50℃1.5min，72℃1min，35个循环；72℃5min。20第二十页，共48页。测序后结果分析

将获得的序列应用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）方法进行结果判定，可以在中药材DNA条形码鉴定系统或GenBank数据库中进行BLAST鉴定中药材DNA条形码鉴定系统http://www.GenBank数据库BLAST鉴定21PCR产物电泳

回收扩增片段进行测序以及序列拼接第二十一页，共48页。中药材DNA条形码鉴定系统22第二十二页，共48页。中药材DNA条形码鉴定数据库中药材DNA条形码鉴定数据库涵盖了中国药典、韩国药典、日本药局方、印度药典、欧洲药典和美国药典几乎所有的中草药药材中草药DNA条形码鉴定数据库每6个月更新一次数据库具有提交数据功能，研究人员可以提交可靠的DNA条形码序列，经审核后提交的DNA条形码序列将被纳入中药材DNA条形码数据库，供世界范围的研究者使用23第二十三页，共48页。DNA条形码分子鉴定的优势是传统鉴定方法的有效补充：直接从基因水平上提供鉴别依据，可以实现对中药材原植物、饮片、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确鉴定，尤其适合以不同部位入药的中药材的物种鉴定可建立数据库，实现中药基源鉴定的标准化：能够构建国际共享的技术平台，形成国际统一的物种鉴定标准；可促进DNA

条形码技术操作的程序化和规范化，实现中药鉴定的标准化和自动化有助于缓解鉴定人才缺乏的现状：不依赖于个人经验，操作人员经过培训可得到客观准确的结果促进中药新资源的开发利用：寻找分子水平上密切联系的物种，发现可替代的新的资源物种利于对中药资源生物多样性的保护：加快发现新种的速度，并有可能解决形态学手段难以攻克的隐存种问题，揭示动植物隐存多样性利于在中药材生产和流通环节的监管：可通过二维码技术进行联网监管和溯源24第二十四页，共48页。中药材DNA条形码分子鉴定法方法流程25样品采集DNA提取PCR扩增电泳凝胶成像条带测序试剂盒CTAB法序列拼接数据分析胶回收物种鉴定DNA质控核心：核酸提取PCR法测序第二十五页，共48页。《中药分子鉴定通则》团体标准正式发布2016年12月12日，中华中医药学会批准《中药分子鉴定通则(T/CACM010-2016)》标准，并予以公告由中国中医科学院中药资源中心、中国食品药品检定研究院、国药种业有限公司起草适用于对主要中药材、中药饮片、中药提取物、中成药、中药材种子种苗生产基地、加工、经营等场所开展的抽样检验活动中，需要对其进行真实性验证或身份鉴定的，允许采用DNA分子检测方法分为三个部分，即第1部分：中药材与中药饮片、第2部分：中药提取物与中成药、第3部分：中药材种子种苗26第二十六页，共48页。中草药参考基因库计划2017年3月，Illumina与中国医学科学院药用植物研究所（IMPLAD）签署协议，开展千种药用植物基因组计划（1KMPG），共同创建世界首个药用植物参考基因库。分两个阶段，第一批500种药用植物，第二批500种药用植物，共计1000种主要测叶绿体基因组序列利用行业领先技术促进药用植物基因测序与精准鉴定，确保中医产品的质量、安全和有效性，为中医药全面步入国际市场奠定坚实的基础27第二十七页，共48页。关注单位各地食品药品监督管理局各地食品药品检验检测中心/所当地药企（希望在行业内建立更先进更高的标准）一些跟中药相关的科研单位28数字化中药时代来临啦！第二十八页，共48页。目标客户群及销售机会各地食品药品检测中心国家强制执行中药材分子检测，各地中药材分子检测平台建设各种中药材分子鉴定方法的开发规模较大的中药材生产企业国家强制执行中药材分子检测，中药材分子检测平台建设各种中药材分子鉴定方法的开发

中药相关的科研单位各种中药材分子鉴定方法的开发29第二十九页，共48页。客户现实情况国家强制执行2015年药典中药分子检测方法负责人非生物专业具体操作人员不专业如何建立PCR实验室不清楚试验问题解决没概念第三十页，共48页。耶拿公司优势整体解决方案，全套产品线专业的技术支持完善的售后服务第三十一页，共48页。32样品处理核酸纯化核酸定量体系构建核酸扩增电泳检测成像分析德国耶拿的解决方案第三十二页，共48页。SpeedMillPlus快速匀浆器——高效中药材破碎

高效：采用独特的微珠垂直冲击破碎法，可进行高效、完全的细胞破碎快速：可同时处理20个样品，几十秒至几分钟即可完成方便：样品管支架可预先放在-80℃等低温环境中预冷，进一步保证破碎时样品温度的有效致冷，无需额外的液氮、干冰等制冷剂应用广泛：可处理的样品种类广泛，如各类中药材、动物组织（内脏、干质样品、昆虫、软骨组织等）、植物组织（叶、茎、根、花、果实、种子等）、各类真菌等33第三十三页，共48页。InnuPureC16自动核酸纯化仪——全自动中药材DNA提取

产物无磁珠残留：无需离心即可直接应用于下游工作无污染：即用型试剂密封预装，tip自动穿刺取样，避免外源污染及交叉污染，紫外灯可有效清洁仪器内部方便：不用加液，不用离心，不用操作电脑软件，不用编程，只需加入样品，选择程序，仪器自动完成提取工作。免费提供核酸纯化程序并终身免费升级灵活：最快40分钟处理1-16个样品34第三十四页，共48页。DNA提取试剂盒——有效解决中药材DNA难提取的问题

耶拿公司拥有专利性的最新核酸纯化技术DualChemistryTechnology(DC-Technology,双缓冲液技术)，与传统的高离子强度离液盐试剂盒相比，有以下优点：提供了更为温和稳定的裂解环境，提高核酸提取的得率提供了更为温和的生存环境，提高核酸产物的完整性和活性低盐浓度缓冲液体系可以有效减少清洗步骤，提高核酸纯度得到的核酸产物对下游应用无抑制作用，可以长久储存35植物DNA提取试剂盒：

含有三种不同的裂解缓冲液，特别适用于成分复杂、DNA难以提取的中药材样品第三十五页，共48页。德国耶拿的innuPREPPlantDNAKit独特点：提供三种裂解缓冲液SLS,OPT,CBV，有效应对中药材复杂样品361、石斛--SLS2、南柴胡---SLS3、南柴胡---OPT4、北柴胡---SLS5、北柴胡----OPT6、石斛—OPT结论：石斛用OPT提取效果好柴胡用SLS提取效果好唯一专利性的DC-Technology双缓冲液技术提取石斛和柴胡DNA第三十六页，共48页。ScanDrop超微量核酸蛋白测定仪——对提取的DNA质量进行把关

多功能：是常量、微量、超微量的完美结合，具有三种检测模式，满足各种需求超微量：最低样品量仅需0.3µl高通量：能用两种检测光程连续检测16个样品结果准确稳定：检测光程固定，独有的双光束光路系统，密闭的检测环境，确保检测结果的高度准确性和重复性快速：仪器即开即用，多个样品自动连续检测，操作简便37第三十七页，共48页。BiometraTAdvanced基因扩增仪——高效的基因扩增

快速：镀金纯银样品槽，实现高效传热效果和快速的升降温速率，最快升温速度可达到8℃/s精准的温度控制：优异的温度准确性0.1℃/s，均一性0.15℃/s线性温度梯度：实现准确的温度梯度设置和控制，方便退火温度的优化静音技术

：运行时非常安静，无噪声，提供舒适的工作环境仪器自检功能：可进行自动的检测诊断，确保仪器运行正常舒适：超大的7英寸彩色触摸屏，高清显示，操作直观方便结识耐用：久经考验的德国品质，30年的PCR仪制造经验38第三十八页，共48页。Compact系列水平电泳——DNA分离

Compact系列水平电泳是经典的简便型电泳产品的代表，厚实的有机玻璃、耐用的铂金电极和镀金的安全插头，处处彰显着该产品系列高贵且耐用的品质。Compact系列按照凝胶大小可分为六种型号。皮实耐用：材料厚度是同类产品的三倍以上，极其结实耐用操作方便：安全盖子有宽厚的边翼，可以稳定地竖直放置在桌面上，不占用空间，操作方便且不易污染；制胶操作极其简单，一步即可完成制胶器的组装凝胶托盘具有UV穿透性，可直接在紫外灯下观察凝胶结果39第三十九页，共48页。UVsolotouch独立型凝胶成像仪——核酸成像分析

系统自带10英寸彩色触摸显示屏，凝胶结果直接实时显示，不需要配置电脑独有的四开窗设计，无需开门即可观察凝胶和切胶，操作更加安全紫外光强度有三个档次可设定，高档用于凝胶成像和拍照，中档用于样品的快速切胶取样，低档用于样品的较长时间切胶取样带有自动的安全保护装置，前舱门打开时紫外灯会自动熄灭，避免操作者受到紫外光的直接照射。若10min无操作，紫外灯会自动熄灭，以延长紫外灯的使用寿命图片可以tif、jpg、gif等格式存储在仪器里，也可通过前端的USB接口导出，还可通过无线或有线网络传输至电脑中40第四十页，共48页。PCRUV2/UV3加样工作台——PCR洁净加样41高效灭菌：短波紫外灯灭菌多重过滤：三级过滤装置，网筛预过滤、活性炭过滤、HEPA过滤功能齐全：内置电源接口，置物架杜绝外源污染和交叉污染！第四十一页，共48页。42大量加样工作手工移液器加样自动化系统加样效率低下容易出错加样不稳定身心疲惫效率高不易出错加样稳定解放人力大量样品不易出错结果可靠第四十二页，共