临床基因扩增检验实验室工作规范

临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。

一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理

临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。

临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。

清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

(一)试剂贮存和准备区

下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。

主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。

在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。

严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。

工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯(254nm波长)，在工作完成后调至实验台上60-90cm内照射。由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。

(二)标本制备区

下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。

要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。

用过的加样器吸头必须放入专门的消毒(例如含次氯酸钠溶液)容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等)如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。

对实验台适当的紫外照射(254nm波长，与工作台面近距离)适合于灭活去污染。可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。

样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。

用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成，因为cDNA链较RNA稳定，保存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。

cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后再开盖以调节缓液或加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。

待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩增。

(三)扩增区

下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

不能从本区再进入任何"上游"区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。

为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。

打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。一个简单的(六)靶核酸的逆转录(RT)和扩增

1、靶RNA的逆转录

cDNA合成为逆转录PCR中的第一个酶反应步骤，所产生的cDNA为靶RNA的反向互补链，为后面扩增的模板。下述因素通常影响cDNA合成的效率：(1)逆转录效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等；(2)用于逆转录的标本中存在逆转录或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血红素等)；(3)RNA酶的存在导致RNA的降解。

2、核酸的扩增

有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要，必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查，以避免假阴性结果。

(七)污染

在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染(产物污染)；天然基因组DNA的污染、试剂污染(贮存液或工作液)以及标本间交叉污染(如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本)。临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。

由于一旦发生污染后，再围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐，所以防止污染重在预防。但如果发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为止，并且实验结果必须作废。

1、测定分析前的污染源

测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。

2、测定分析阶段的污染源

通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂(例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油)、商品酶制剂、消耗品(如反应管，吸头)和实验设备(如加样器、离心机)等。

在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取扩增产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定标准操作程序(SOP)，并严格执行。

3、污染的避免

要避免污染，首先应是预防而不是排除污染，前面所述对工作区的严格划分的目的即是为了预防污染。

为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增反应中用dUTP取代部分dTTP，使得产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对以后要进行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂素光化学产生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反应但又不妨碍PCR后杂交过程，所以这种方法也能防止污染。

上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其来替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的天然DNA的污染。

4、去除污染的措施

工作完后必须定期对实验室采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：(1)用10%(v/v)次氯酸钠清洁表面；(2)试验后长时间的紫外照射实验操作台面和其他表面；(3)实验设备如加样器的高压消毒。

(八)扩增产物的分析

扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等，但临床PCR检验项目基本上都使用探针杂交方法。

杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。

最常使用的基因探针有：DNA片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义RNA探针。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。

在扩增后的杂交检测中,应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性，还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高温度和/或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂的离子强度是避免假阳性和假阴性结果的先决条件。要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。

(九)质量控制

质量控制包括两个方面，即室内质量控制(以下简称质控)和室间质量评价。

1、室内质量控制

必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准确性和重复性。由于核酸扩增测定的高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每一步都要求有质控措施。

(1)标本制备：

常用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA提取效果，以判断所提取的DNA是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的DNA的平均长度一般为~100kb，用适合PCR的DNA提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为30-40kb。明显出现降解的DNA(在1和10kb的低分子量范围内)在经琼脂糖凝胶电泳分离和用溴化乙锭染色后也可见强的荧光信号。用对甲基化不敏感的限制性内切酶(如EcoRI)消化DNA，然后电泳分离，能够对酶活性的抑制剂进行质控(在抑制剂存在的情况下，高分子量的片段不被酶切)。潜在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计，质量好的DNA提取物，A260/A280比值应该在1.75-2.0之间;否则,残留的蛋白或酚可能会很高。仅用光度计比色方法不能对DNA的完整性下结论。

最快的对总RNA提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电泳,这一点跟DNA分离相同。但如果对结果有疑问,就应该在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的完整性。在理想情况下,三种主要的核糖体RNA(28S、18S和5S)在凝胶上出现的带相对较窄。如发生RNA的降解，则出现大量低分子量带或出现带的消失。测定核糖体RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的实验室内的标准；对向低分子量拖尾的、不对称性的峰的评估也是RNA完整性的合适的指标。另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些原因，单独的光度计比色方法也不能对RNA的完整性下结论。

对于血清（浆）中病毒的测定，则要评价标本出现溶血、脂血和黄胆情况下标本处理方

法对扩增检测的影响，避免由于标本处理方法的不当而出现假阴性结果。此外，还可采用已知浓度标本评价核酸提取方法的效果。

(2)逆转录和扩增：本部份包括阳性质控和阴性质控。

对逆转录和核酸扩增的质控既可使用内标质控方法也可采用外标质控方法。逆转录-扩增检测的内标通常为在整个细胞周期中均匀表达的mRNA，如HLA、β肌动蛋白和组蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。此外，也可在标本制备时将外来内标加入到样本****同提取、逆转录及扩增。当标本中存在逆转录抑制物，或核酸提取中发生RNA降解，或逆转录酶失活，内标即会表现为阴性结果。对于DNA测定内标可使用对有机体存活所必须的靶基因，如维生素D血浆结合蛋白的基因。对于病原体的基因检测，内标多采用人工制备的竞争性内标。内标可以监控每一扩增孔中假阴性的产生情况。

目前的商品试剂盒大部分没采用内标方法质控。因此在测定血清/血浆病原体核酸如HBVDNA、HCVRNA等时，应使用已知的弱阳性血清/血浆作为质控样本，与待测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断逆转录及扩增检测的效果。

使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液的质量，还可获得有关PCR试剂的检测下限和特异性的信息。这些质控样本在扩增检测时必须使用与患者的标本相同的主反应混合液。

每一个PCR实验中都必须设有外加阴性质控(污染监测质控)，为判断扩增过程中污染出现的阶段，阴性质控可包括如下几种，即在样品制备的整个过程中所带的空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板的反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估PCR实验的综合质量。

在扩增靶RNA的RT-PCR实验中，可做省略逆转录的污染质控，通过这种方法，可发现以前扩增的DNA片段所引起的污染。

(3)板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。

(4)测