发酵过程控制优秀公开课件

第六章发酵过程控制微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度、糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。微生物发酵类型1工艺控制参数2菌体浓度的影响和控制3温度的影响及其控制4pH值影响及其控制5溶氧的影响及其控制6泡沫的影响及其控制7发酵终点的判断8主要内容一、分批发酵定义：指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。蒸汽空气发酵尾气消泡剂酸碱在分批培养过程中，随着微生长细胞和底物、代谢物的浓度等的不断变化，微生物的生长可分为延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期等四个阶段，细菌丝状真菌和放线菌优点：●操作简单●操作引起染菌的概率低●不会产生菌种老化和变异等问题缺点：非生产时间较长、设备利用率低。如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。二、补料分批发酵1、定义补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。连续流加、不连续流加、多周期流加快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加单组分流加、多组分流加补料方式流加操作控制系统反馈控制无反馈控制直接方法间接方法以溶氧、pH值、呼吸商、排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数三、连续发酵培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。优点：能维持低基质浓度；可以提高设备利用率和单位时间的产量；便于自动控制。缺点：菌种发生变异的可能性较大；要求严格的无菌条件。一、物理参数1.温度（℃）：指整个发酵过程或不同阶段中所维持的温度。2.压力（Pa)：这是发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内维持正压可以防止外界空气中的杂菌侵入，以保证纯种的培养。同时罐压的高低还与氧和CO2在培养液中的溶解度有关，间接影响菌体的代谢。罐压一般维持在表压0.02~0.05MPa(0.2~0.5大气压)。3.搅拌转速（r/min）：指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每分钟的转数来表示。它的大小与氧在发酵液中的传递速率和发酵液的均匀性有关。4.搅拌功率（kW）：是指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每立方米发酵液所消耗的功率（kW/m3）。它的大小与液相体积氧传递系数KLa有关。5.空气流量（V/V.min）：指每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，它是需氧发酵中重要的控制参数之一。它的大小与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在0.5~1.5V/V.min范围内。6.黏度（Pa.s）：粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。通常用表观粘度表示。它的大小可影响氧传递的阻力，也可反映相对菌体浓度。二、化学参数1．pH（酸碱度）发酵液的pH值是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。它是发酵工艺控制的重要参数之一。它的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。2．基质浓度（g％或mg%)是指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。因此，在发酵过程中，必须定时测定糖（还原糖和总糖）、氮（氨基氮或胺氮）等基质的浓度。3.溶解氧浓度(mmol/L,mg/L,饱和度％)溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。氧是微生物体内的一系列的经细胞色素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也是合成某些代谢产物的基质。利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规津，反映发酵的异常情况，也可作为发酵中间控制的参数及设备供氧能力的指标。4．氧化还原电位（mV)培养基的氧化还原电位是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。对各种微生物而言，培养基最适宜和所允许的最大电位值，应与微生物本身的种类和生理状态有关。5．产物的浓度（µg/ml）这是发酵产物产量高低或生物合成代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。6.废气中氧的含量（％）废气中氧的含量与产生菌的摄氧率有关。从废气中氧和CO2的含量可以算出产生菌的摄氧率、呼吸商和发酵罐的供氧能力。7.废气中CO2的含量（％）废气中的CO2是由产生菌在呼吸过程中放出的，测定它可以算出产生菌的呼吸商，从而了解产生菌的呼吸代谢规律。参数名称测试方法参数名称测试方法温度传感器粘度粘度计压力压力表装量传感器空气流量传感器浊度传感器搅拌转速传感器泡沫传感器pH传感器溶解氧传感器要求使用的传感器能耐蒸汽灭菌；菌体浓度及某些基质浓度至今仍无适合的传感器可供使用。第三节发酵工艺的控制菌体浓度温度pH溶解氧泡沫补料一、菌体浓度对发酵的影响及控制菌体（细胞）浓度（简称菌浓，cellconcentration）是指单位体积培养液中菌体的含量。菌浓的大小，在一定条件下，不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性不完全相同的各个分化阶段。2、菌浓的大小对发酵产物的形成

有哪些重要的影响？在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系，此时菌浓愈大，产物的产量也愈大。如氨基酸、维生素这类初级代谢产物的发酵以及抗生素这类次级代谢产物的发酵都是如此。菌浓过高，则会产生其他的影响：营养物质消耗过快，培养液中的营养成分发生明显的改变，有毒物质的积累，就可能改变菌体的代谢途径；影响培养液中溶解氧，随着菌浓的增加，培养液的摄氧率（OUR,OxygenUptakeRate）按比例增加（OUR=Qo2·X),表观粘度也增加，流体性质也发生改变，使氧的传递速率（OTR,OxygenTransferRate)成对数地减少，溶解氧减少。3、菌浓的大小可采用哪些不同的方法来控制？依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。首先确定基础培养基配方中有个适当的配比，避免产生过浓（或过稀）的菌体量。然后通过中间补料来控制，如当菌体生长缓慢、菌浓太稀时，则可补加一部分磷酸盐，促进生长，提高菌浓；但补加过多，则会使菌体过分生长，超过临界浓度，对产物合成产生抑制作用。磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol/L，次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L.磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。二、温度对发酵的影响及其控制微生物发酵所用的菌体绝大多数是中温菌，如霉菌、放线菌和一般细菌。它们的最适生长温度一般在20～40℃。影响各种酶的反应速率和蛋白质性质影响发酵液的物理性质影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。产热因素：生物热（Q生物）、搅拌热（Q搅拌）散热因素：蒸发热（Q蒸发）、辐射热（Q辐射发酵热（Q发酵）是发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射1、影响发酵温度变化的因素2、温度的控制最适温度的选择在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行选择。温度的控制工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹套（10M3以下）或蛇管中（10M3以上），通过热交换来降温，保持恒温发酵。如果气温较高（特别是我国南方的夏季气温），冷却水的温度又高，致使冷却效果很差，达不到预定的温度，就可采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适温度。因此大工厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证在正常温度下进行发酵。三、pH值对发酵的影响及其控制在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。1、pH对发酵的影响影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。在发酵过程中，pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。pH值的变化发生在菌体生长阶段、产物生成阶段、细胞自溶阶段。引起pH下降的因素：碳源过量、消泡油添加过量、生理酸性物质的存在引起pH上升的因素：氮源过多、生理碱性物质的存在、中间补料，碱性物质添加过多2、发酵pH值的确定原则：有利于菌体生长和产物的合成。微生物发酵的最适pH值范围一般是在5～8之间，根据实验结果确定。最适pH与菌株，培养基组成，发酵工艺有关。应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。3、pH值的控制调节基础培养基的配方调节碳氮比（C/N）添加缓冲剂补料控制直接加酸加碱补加碳源或氮源补充生理酸性物质(NH4)2SO4或碱性物质【压缩氨气或工业用氨水（浓度20％左右）】青霉素发酵的补料工艺，图中实线是用酸、碱来控制pH的，虚线是以控制加糖速率来控制pH的。两者的加糖量是相等的。这说明以pH作为补糖的依据，采用控制加糖率来控制pH，正好满足菌体合成代谢的要求，使产量提高25%。四、溶解氧对发酵的影响及其控制在发酵过程中，影响耗氧的因素有以下几方面：（1）培养基的成分和浓度（2）菌龄（3）发酵条件生长于不同基质上的不同微生物的需氧要求基质微生物g氧/g干菌体葡萄糖大肠杆菌0.4甲醇假单胞菌1.2辛烷假单胞菌1.7在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数。调节搅拌转速或通气速率来控制供氧；控制补料速度来控制基质的浓度，从而达到最适的菌体浓度，保证产物的比生长速率维持在最大值，又不会使需氧大于供氧。采用调节温度（降低培养温度可提高溶氧浓度）、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施，来改善溶氧水平。五、泡沫对发酵的影响及其控制泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。发酵过程中所遇到的泡沫，其分散相是无菌空气和代谢气体，连续相是发酵液。1、泡沫的形成由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌）；发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）。蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等糊精含量多当发酵感染杂菌和噬菌体时，泡沫异常多。2、起泡带来的不利因素：发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小，降低发酵设备的利用率造成大量逃液，增加了染菌的机会导致产物的损失消泡剂会给后提取工序带来困难严重时通气搅拌无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶。3、泡沫的消除调整培养基中的成分（如少加或缓加易起泡的原料）或改变某些物理化学参数（如pH值、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。采用机械消泡或消泡剂来消除已形成的泡沫。采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。（1）机械消泡物理消泡方法，利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂。罐内消泡——靠罐内消泡桨转动打碎泡沫。罐外消泡——将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或离心力来消除泡沫。优点：节省原料，减少染菌机会。缺点：消泡效果不理想，仅可作为消泡的辅助方法。（2）消泡剂消泡A.消泡剂的作用：降低泡沫液膜的机械强度；降低液膜的表面黏度；兼有两者的作用，达到破裂泡沫的目的。B.作为生物工业理想的消泡剂，应具备下列条件：应该在气－液界面上具有足够大的铺展系数，才能迅速发挥消泡作用，这就要求消泡剂有一定的亲水性；应该在低浓度时具有消泡活性；应该具有持久的消泡或抑泡性能，以防止形成新的泡沫；应该对微生物、人类和动物无毒性；应该对产物的提取不产生影响；不会在使用、运输中引起任何危害；来源方便，成本低；应该对氧传递不产生影响；能耐高温灭菌。C.常用的消泡剂有4大类：天然油脂类高级醇类：十八醇，聚二醇聚醚类硅酮类：聚二甲基硅氧烷及其衍生物。以天然油脂类和聚醚类在生物发酵中最为常用。豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和猪油等。油不仅用作消泡剂，还可作为碳源和发酵控制的手段。在发酵中，要控制油的质量、新鲜程度，并要进行发酵试验检验。聚氧丙稀甘油（GP型）——氧化丙稀和甘油聚合；亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以用于稀薄发酵液中要比用于粘稠发酵液中的效果好；抑泡性能比消泡性能好，适宜用于基础培养基中，以抑制泡沫的产生。聚氧乙烯氧丙稀甘油（GPE型，泡敌）——氧化丙稀、环氧乙烷与甘油聚合；亲水性好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，作用快，溶解度大，消泡活性维持时间短，用于粘稠发酵液的效果比用于稀薄的好。D.应用消泡剂时的增效方法：加载体增效，即用惰性载体（如矿物油、植物油等）使消泡剂溶解分散，达到增效的目的；消泡剂并用增效，取各种消泡剂的优点进行互补，达到增效；乳化消泡剂增效，用乳化剂（或分散剂）将消泡剂制成乳剂，以提高分散能力，增强消泡效力，一般只适用于亲水性差的消泡剂。GP和GPE1:1混合使用于土霉素发酵，结果比单独使用GP的效力提高2倍。用吐温-80制成的乳剂，用于庆大霉素发酵，效力提高1～2倍。在生产过程中，消泡的效果除了与消泡剂的种类、性质、分子量大小、消泡剂亲油亲水基团等密切香港外，还与消泡剂使用时加入方法、使用浓度、温度等有很大关系，应结合生产实际加以注意和解决。第四节发酵终点的判断要确定一个合理的放罐时间，需要考虑下列几个因素：一、经济因素以最低的成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。二、产品质量因素三、特殊因素在正常情况下，可根据作业计划，按时放罐；在异常情况下，如染菌、代谢异常（糖耗缓慢等），就应根据不同情况，进行适当处理，以免倒罐。为了能够得到尽量多的产物，应该及时采取措施（如改变温度或补充营养等），并适当提前或拖后放罐时间。第五节异常发酵及处理染菌非染菌一、染菌（一）染菌的途径分析设备渗漏空气染菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善上海第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析染菌原因百分率（％）外界带入染菌（取样、补料等）8.20设备穿孔7.60空气系统有菌26.00停电罐压跌零1.60接种（倒种）11.00蒸汽压力不够或蒸汽量不足0.60管理问题7.09操作违反规程1.60种子带菌0.60原因不明35.00日本工业技术发酵研究所抗生素发酵染菌原因分析项目百分率（％）项目百分率（％）种子带菌9.64接种管穿孔0.39接种时罐压跌零0.19阀门渗漏1.45培养基灭菌不透0.79轴封渗漏2.09空气系统有菌10.96罐盖漏1.54泡沫冒顶0.48其他设备泄漏10.13夹套穿孔12.36操作问题10.15盘管穿孔5.89原因不明24.91（二）染菌的判断镜检无菌试验溶氧变化规律各个罐染同一种菌，总过滤器、空气主管、总空气系统失效同一产品的几个罐染菌菌种带菌发酵前期菌种带菌发酵后期补料、补油个别罐染菌设备本身问题与种子同步的染菌斜面问题发酵中期培养基，设备，操作问题芽胞杆菌污染，存在死角、团块；非芽胞杆菌污染，多数为空气系统失败，设备渗漏；霉菌污染，环境、无菌室污染；G－污染，冷却水