免疫学生物24标记技术

免疫标记技术第二十四章潍坊医学院免疫学教研室王丽娜工号：11075Tel：8462530E-mail：myx@目的要求掌握免疫标记技术的原理掌握免疫标记技术的种类、原理及用途熟悉蛋白质芯片技术的原理及用途免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术

免疫标记技术是将抗原抗体反应和标记技术相结合，将已知的抗体或抗原标记上示踪物质，通过检测标记物，间接测定抗原-抗体复合物的一类方法。PartI免疫标记技术

优点：特异、敏感、精确、快速、可定性、定量甚至定位，操作简便，易于商品化和自动化。常用标记物：荧光素（异硫氰酸荧光素、罗丹明）酶（辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）放射性同位素（125I）生物素、铁蛋白、胶体金、化学发光物质免疫荧光技术酶免疫技术放射免疫测定法发光免疫测定法免疫标记技术一、免疫酶测定法（enzymeimmunoassayEIA)酶免疫测定法是一种用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法。常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）常用的酶的底物（1）辣根过氧化物酶（HRP）常用底物：邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性。四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。（2）碱性磷酸酶（AP）对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassayELISA）：检测可溶性抗原，可定性、定量，不能定位酶免疫组化（IHC）：检测组织和细胞中的抗原，可定性、定位，不能定量常用的方法：(一)酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，ELISA)概念用酶标记抗原或抗体，将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的技术。可敏感的检测体液中微量的特异性抗体或抗原。可定性、定量、不能定位原理使Ag或Ab结合到某种固相载体表面，保持其免疫活性。用酶标记Ag或Ab，同时保留免疫活性和酶活性。将受检标本和酶标物质按不同步骤与固相载体表面物质反应，洗涤游离物质。酶将底物催化，显色深浅与受检Ag或Ab的量成正比。借助颜色反应的深浅来定性、定量Ag或Ab。比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光值。

比色结果的表达以往通用光密度(opticaldensity,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为490nm，表示方法为"A490nm"或"OD490nm"。EquipmentforperformingtheELISAtestPipettesIncubatorELISAreader

特点敏感性高、特异性强、操作简单、结果易观察常用方法：

1.双抗体夹心法：最常用来检测抗原

2.间接法：最常用来检测抗体

3.BAS-ELISA:提高实验敏感性1)双抗体夹心法包被抗体加待检抗原加酶标二抗加酶的底物洗涤洗涤洗涤todetectAg

2)间接ELISA包被抗原洗涤洗涤洗涤加酶的底物加待检抗体加酶标二抗3)BAS-ELISA(biotin-avidinsystem,BAS-ELISA)这是在ELISA中引入一个放大系统。生物素（biotin）是广泛存在于生物组织中的一种生长因子，可以标记抗体和酶而不影响其活性。亲和素（avidin）是从卵白中提取的一种蛋白质，也可从链霉菌培养滤液中提取链霉亲和素(streptavidin)。一个亲和素分子可结合4个生物素分子。一个Ig分子可偶联90个生物素分子。一抗二抗（生物素化）SABC（标有AP）底物-AP-APAP-3)BAS-ELISA(biotin-avidinsystem,BAS-ELISA)BAS的优点：BAS-ELISA比标准ELISA的敏感性大大提高。BAS的缺点：亲和素是PI较高的糖蛋白，对聚苯乙烯、硝酸纤维素膜、DNA有较高的非特异吸附，在ELISA、免疫组化、DNA杂交等检测中应用出现较高的背景着色。

5）斑点ELISA(dot-ELISA)优点：灵敏度较一般ELISA高6～8倍、可达ng水平。试剂用量小，不需其它设备条件。（二）免疫组化技术

是应用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性、定量检测的技术。特异性可见性间接SABC-AP法

T细胞亚群检测

CD分子T细胞一抗（小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子mAb）二抗（生物素化）SABC（标有AP）底物-AP-APAP-小鼠肝癌石蜡切片免疫组化二、免疫荧光技术

免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)是免疫标记技术中发展最早的一种。是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC）--黄绿色荧光四乙基罗丹明（RB200）--明亮橙色荧光四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）--橙红色荧光。标记方法：搅拌法(适合大样品)

透析法(适合小样品)标记抗体的纯化：透析法、层析分离法免疫荧光技术类型

1.直接法优点：操作简便、特异性高、非特异荧光染色因素少。缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。2.间接法优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。缺点：是较易出现非特异性荧光。三、放射免疫测定放射免疫测定法（radioimmunoassay,RIA）是以放射性核素作为示踪剂的免疫标记测定方法，其特点是将核素分析的高灵敏度与抗原-抗体反应的特异性相结合。常用的核素有两大类γ射线：131I、125I、57Cr和60Coβ射线：14C、3H和32P。使用最广泛的是：125I放射免疫测定缺点：使用特殊的仪器设备有放射性危害，需要一定的防护条件。优点：能测出ng/ml（毫微克）甚至pg/ml（微微克）水平的微量物质。样品用量少，精确性好，操作易规范化和自动化。四、发光免疫分析(luminescenceimmunoassay,LIA)

发光免疫技术是将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后

夹心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）直接化学发光的机理根据发光免疫技术中发光标记物不同，分为四种类型。化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmuneassay，CLIA)生物发光免疫测定(bioluminescenceimmunoassay,BLIA)化学发光酶免疫分析(luminescenceenzymeimmunoassay，IEIA)电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）1)化学发光免疫测定（CLIA）用吖啶酯直接标记抗体，与待测标本中相应的抗原发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。2)生物发光免疫测定（BLIA）利用生物发光物质（如萤火虫或发光水母）或参与生物发光反应的辅助因子（如ATP或NAD）等对活细胞进行多种生物学功能检测，例如通过荧光素酶报告基因检测细胞凋亡或检测细胞增殖。3)化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如HRP或AP来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。4)电化学发光免疫分析(ECLIA)电化学发光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。五、免疫胶体金技术（ICS）氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法应用:快速诊断胶体金标记技术的类型

（一）斑点金免疫渗滤试验

斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)是以NC膜为载体，包被抗原或抗体于渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的(一般5min左右完成)。胶体金标记技术的类型

（二）斑点免疫层析试验原理斑点免疫层析试验（dot-immunochromatographicassay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以NC膜为载体，但利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判断实验结果。尿样阳性弱阳性阴性无效质控线测试线举例：如早孕反应试纸条原理吸水垫料C区抗鼠IgGT区鼠抗HCG抗体金标抗HCG抗体吸水垫料样品流向阳性C区T区亦被称为westernblotting，免疫印迹法是将电泳与ELISA结合起来的一种方法分三个阶段进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）电转移酶免疫定位免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样品组分的免疫学测定方法。六、免疫印迹技术（immunoblottingtest，IBT）PartII蛋白质芯片技术蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白质微阵列，是指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子间的相互作用，分析检查蛋白质的一项技术。可以实现快速、准确、高通量的检查。用途蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于：蛋白质表达谱分析研究蛋白质与蛋白质的相互作用DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用生化反应的检测疾病诊断筛选药物作用的蛋白靶点等。特点高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，保证质量。优点1.直接用粗生物样品进行分析2.小量样品3.高通量的验证能力4.发现低丰度蛋白质5.测定疏水蛋白质6.在同一系统中集发现和检测为一体，特异性高利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。面临挑战⑴建立快速、廉价、高通量的蛋白质表