分子克隆试验

本文格式为Word版，下载可任意编辑——分子克隆试验分子克隆试验设计

一、总体试验流程

二、试验内容

(一)PCR（聚合酶链式反应）

1.原理：

利用DNA在体外摄氏95度时解旋，45-60度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至72度左右，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。2.PCR操作：反应体系：Template1ul

Primer11ulPrimer21ul2*TaqmasterMIX25ulH2O22ulTotal50ul

反应条件：94℃5min

94℃30s

58℃30s40cycles72℃40s72℃5min

(二)琼脂糖凝胶电泳

1.原理：

琼脂糖凝胶具有网络结构，分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分开不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。

2.凝胶电泳步骤：

1)称取0.5g琼脂糖至50ml电泳缓冲液（TAE）中，摇匀；同时装置制胶架。

2)加热至琼脂糖完全溶化，期间中止加热摇动3次，即无可见漂泊物，澄清为止。3)参与1ulEB染液，充分摇匀。

4)缓慢倒入制胶架内，冷却30-60min，至凝胶充分凝固，放入电泳槽中即可使用。

5)使用时，将样品点入相应的加样孔内，即可开始电泳，待指示剂位于整块凝胶2/3位置

时，中止电泳，在紫外灯下观测样品条带。

(三)切胶回收（天根生化公司凝胶回收试剂盒）

1.将空小离心管称重。将回收的带DNA片段的凝胶放入其中、再次称重，确定凝胶净重。2.将离心管中的凝胶捣碎以助于凝胶溶解。按胶的重量参与三倍体积的Extractionbuffer（1mg凝胶加3μlExtractionbuffer）。

3.55℃恒温加热直到凝胶完全溶化（5-15分钟）,每隔2-3分钟需将管内混悬液混匀一次。4.依照1：1比例参与异丙醇（1mg凝胶加1μl异丙醇），混匀。

5.将混合液全部移入Spincolumn、6000rpm离心1分钟，弃去接液管中的液体。

6.向Spincolumn中参与500μlExtractionbuffer，12000g离心30-60秒，弃去接液管中的液体。

7.向Spincolumn中参与650μlWashbuffer，12000g离心30-60秒，弃去接液管中的液体。8.重复步骤7一次。

9.再次将Spincolumn离心1分钟后，防备去除残留的液体，将其移入一无菌的1.5ml的离心管中。

10.参与50μl的ElutionBuffer，室温静止1分钟，12000g离心1分钟回收DNA样品。

(四)连接T载体

1.反应体系

2.将连接混合物在室温（22°C）孵育1h。假使转化需要达到最大值，4°C孵育过夜。3.用2.5ul连接混合物直接进行细菌转化。

(五)转化

1.取感受态细胞至于冰浴中溶化。

2.向感受态细胞悬液中参与5ul连接产物，轻轻旋转离心管混匀，冰浴30min。3.将离心管置于42度水浴中60-90s，然后快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要摇动离心管。

4.向离心管中参与600ul无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37度摇床上震荡培养45min，使菌体复苏。

5.分别吸取100ul和300ul，均匀涂布于LB固体培养基上（含抗生素），将平板置于室温直至液体被完全吸收，之后转移至37度，倒置培养12-16h。

(六)挑菌与摇菌

1.使用黄色200ul枪头，挑取单个形态良好的克隆，直接连同枪头打入5mlLB培养基中。每支LB培养基只能打入一个单克隆。2.参与50ulAmp。

3.封好管口，固定放置在37度摇床，振摇12-16h。

(七)质粒提取（天根生化公司质粒小量提取试剂盒）

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）参与500ul的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

2.取1-5ml过夜培养的菌液，参与离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过屡屡离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3.向留有菌体沉淀的离心管中参与250μl溶液P1（请先检查是否已参与RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器完全悬浮细菌沉淀。

4.向离心管中参与250μl溶液P2，温柔地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温柔地混合，不要猛烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。假使未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不完全，应减少菌体量。

5.向离心管中参与350μl溶液P3，马上温柔地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心10min。

注意：P3参与后应马上混合，避免产生局部沉淀。假使上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

(八)酶切与鉴定

通过双酶切法对提取的质粒进行酶切，并将酶切产物凝胶电泳进行鉴定。

(九)试验结果

1.通过PCR成功获得了目的基因，凝胶电泳条带较明了，没有杂带。

2.转化摇菌涂板后，平板上菌落数较少，仅十余个，有的板上甚至一个都没有。但菌落比

较一致。可能是涂板时涂布棒没能完全冷却，杀死了菌体；也可能是摇菌时间不够，菌液浓度偏低。

3.对提取的质粒进行酶切鉴定，酶切质粒凝胶电泳结果只有一条带，而未经酶切的质粒有

两条带（见下图）。分析可能是某个酶有问题，导致质粒只有一个切口。

A：D2000Marker；B：未酶切质粒；C~E：酶切质粒（C、E、F分别为酶切模板3ul、4ul、5ul）

(十)探讨

1.在进行PCR、酶切的试验中，应当注意设置对照组，以便排除一些试验干扰因素，保证

结果的可信性。

2.在凝胶回收中，切胶要确凿，对于又杂带的状况，要判断目的条带（试验中常遇到杂带

比目的条带亮的状况，要注意区分）。切胶要切全，不然回收量不够，但尽量减少多余的胶，否则影响纯化效果。

3.在涂板时，应注意无菌操作，尽量避免杂菌的污染。涂板时，涂布棒烧灼后一定要等冷

却了再涂菌，防治杀死菌体，涂板