普通仪和荧光定量仪的使用

普通仪和荧光定量仪的使用第1页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartI中心PCR(polymerasechainreaction)仪简介PartIIPCR原理PartIII普通PCR仪操作规程PartⅣ荧光定量PCR原理PartⅤ荧光定量PCR仪操作规程第2页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartI中心PCR仪简介荧光定量PCR仪Rotorgene3000普通PCR仪GeneAMPSystem9700第3页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartIIPCR原理AAAA蛋白/酶DNAmRNA蛋白中心法则基因表达转录水平翻译水平基因水平（Realtime）RT-PCRWesternblotPCR核酸的功能是储存和转移遗传信息，指导和控制蛋白质的合成；而蛋白质的主要功能是进行新陈代谢活动和作为细胞结构的组成成分。

第4页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR概念利用DNA聚合酶、一对引物和四种dNTP（三磷酸脱氧核苷酸），对模板DNA反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产物的反应过程，称为PCR。PartIIPCR原理第5页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartIIPCR原理PCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）Mg2+（magnesium）模板（template）第6页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartIIPCR原理PCR扩增的基本反应步骤1、变性：加热至95ºC左右，使模板DNA变性。2、退火：降低温度至适合的温度（55ºC左右，引物与模板DNA的互补序列配对结合。3、延伸：温度在70ºC左右时，TaqDNA聚合酶从引物3'端催化复制链以5'

-3'方向延伸。第7页，共36页，2023年，2月20日，星期五1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PartIIPCR原理第8页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartIIPCR原理PCR原理PCR的理论方程：Y=x×(1+Ev)n

Y：扩增物数量；X：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数第9页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartIII普通PCR仪操作规程开机操作：打开PCR仪电源开关；向后平推PCR仪顶盖，放入PCR薄壁管。向前平推PCR仪顶盖，并均匀用力将反扣部分压下。注意：9700PCR仪必须使用圆头的PCR薄壁管。第10页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR仪软件操作指南：PartIII普通PCR仪操作规程GeneAmpPCRSystem9700Version3.05User:***RunCreatEditUtilUserF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第11页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR仪软件操作指南：PartIII普通PCR仪操作规程SelectUserName<<pre>>cqllyf

……AcceptNewEditDeleteCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第12页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR仪软件操作指南：PartIII普通PCR仪操作规程UserName___UseENTERkeytoselectacharacter.AcceptBackspCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopabcdefghijklmnopqrstuvwxyz第13页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR仪软件操作指南：PartIII普通PCR仪操作规程MethodsizelastusedExp000qin0903/01/06Exp001qin1904/10/06StartViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第14页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR仪软件操作指南：PartIII普通PCR仪操作规程StartReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08第15页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR仪软件操作指南：PartIII普通PCR仪操作规程MethodsizelastusedExp000qin0903/01/06Exp001qin1904/10/06EditViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第16页，共36页，2023年，2月20日，星期五PCR仪软件操作指南：PartIII普通PCR仪操作规程EditReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08第17页，共36页，2023年，2月20日，星期五关机操作：实验结束后点击Exit至出现主界面，关闭PCR仪电源开关；均匀用力将反扣部分抬起，向后平推PCR仪顶盖，取出PCR薄壁管。向前平推PCR仪顶盖。PartIII普通PCR仪操作规程第18页，共36页，2023年，2月20日，星期五

首先，传统的PCR检测方法在测定PCR扩增产物前需打开反应管，容易造成产物污染，成为“假阳性”的主要来源。实时PCR在扩增过程中动态检测，完全以闭管方式进行，不仅操作简便，也杜绝了产物污染源。其次，传统PCR都是在PCR到达平台期后进行检测。PCR经过指数期后，对反应条件的变化十分敏感，扩增到达平台期的信号强度重现性很差。实时PCR方法则在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此具有重复性。PartIV荧光定量PCR原理第19页，共36页，2023年，2月20日，星期五定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度PCR循环=双链DNA=染料=荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBRGreenI取代EBPartIV荧光定量PCR原理第20页，共36页，2023年，2月20日，星期五激发光Ct值PartIV荧光定量PCR原理使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。第21页，共36页，2023年，2月20日，星期五PartIV

荧光定量PCR原理实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控PCR反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。第22页，共36页，2023年，2月20日，星期五荧光定量PCR标记方法内掺式染料

SYBRGreenI序列特异性探针

Taqman MolecularBeacons

FRET引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)PartIV荧光定量PCR原理第23页，共36页，2023年，2月20日，星期五SYBR-GreenI

dsDNA的内插染料是一种能插入到双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比。如SYBRGreenⅠ染料，当它没有结合上双链DNA时，只发出相对弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链DNA里时，荧光信号将会强烈地增加，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。PartIV荧光定量PCR原理第24页，共36页，2023年，2月20日，星期五5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PartIV荧光定量PCR原理第25页，共36页，2023年，2月20日，星期五5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

PartIV荧光定量PCR原理第26页，共36页，2023年，2月20日，星期五双标记探针（TaqmanProbe）

5’端标记荧光分子（如：FAM），在3’端标记一个吸收或淬灭荧光的分子（如：TAMRA），这样5’端激发出的荧光会被3’端的分子淬灭或吸收掉，所以开始时，仪器并不能检测到荧光。由于Taq聚合酶同时具有5’端外切酶的活性，在PCR反应的延伸阶段，Taq酶会把5’端的荧光分子切下，使其与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR产物扩增量的增加。PartIV荧光定量PCR原理第27页，共36页，2023年，2月20日，星期五RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitationPartIV荧光定量PCR原理第28页，共36页，2023年，2月20日，星期五RealTimePCR引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=>对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物第29页，共36页，2023年，2月20日，星期五两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer长度80-150bp(尽量限制在300bp以内)★扩增片段大小★17-25base使用BLAST检索，确认引物特异性★★★特异性

△

引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列

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引物3’末端避免2base以上的互补序列★★★互补性3’末端序列

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整体上碱基不能过偏

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个别部分避免GCrich或ATrich(特别是3’端)

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避免T/C连续，A/G连续★序列★

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3’末端避免GCrich或ATrich

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3’末端碱基最好为G或C

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3’末端碱基尽量避免为T尽量在Exonjunction上设计引物，限制基因组DNA扩增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物设计原则第30页，共36页，2023年，2月20日，星期五线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认PCR扩增效率（E）：0.8-1.235Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。NoTemplateControl确认30Cycles内无引物二聚体产生。相关系数（r2）：大于0.98反应性能确认第31页，共36页，2023年，2月20日，星期五1、开始运行仪器 打开PCR仪底座开关，再打开定量PCR仪检测器开关。实验前先让系统预热30分钟，打开电脑，启动iQ5软件。2、放置样品 将PCR反应体系加入到0.2ml的薄壁管或96孔板中，盖上管盖。注意，必须带一次性塑料手套，不要让