犬瘟热及其诊断与防制课件

犬瘟热及其诊断与防制预防兽医

犬瘟热（caninedistemper，CD）是CDV引起的犬科、鼬科和浣熊科等动物的一种急性、热性、高度接触性传染性疾病。以早期表现双向热、急性鼻卡他以及随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。犬感染CDV的死亡率可达90%，甚至90%以上。犬瘟热最早发现于18世纪后叶。1905年卡尔（carre）发现其病原为病毒。我国于1968年首次在黑龙江一野生动物饲养场发现犬瘟热。截至目前,世界各国凡是有犬科动物生存的地区都有本病发生。随着CDV对动物流行因素的不断适应,其自然感染宿主范围在不断扩大,加之CDV变异株的出现,犬瘟热的发病率和致死率仍居高不下,流行趋势由散发向群发发展,临床症状越来越复杂,其危害也越来越大。此外,最新研究证实CDV在体外可感染人的前体破骨细胞,在破骨细胞内增殖,表明CDV的自然宿主可能已扩展到了人类。鉴于上述因素,国际动物卫生组织(OIE)始终将其作为重点关注的疫病之一。主要内容一、病原与流行病学二、发病机理与主要临床特征三、诊断技术1、胶体金免疫层析技术2、RT-PCR和核酸探针技术3、包涵体检查4、血清学技术5、病毒分离四、CD的防制

F蛋白介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞的融合,使病毒具有在体内扩散的能力,同时,还担负着刺激机体产生中和抗体的职能,在抗病毒免疫中具有重要地位。在麻疹病毒属（MV）成员中,MV、CDV和牛瘟病毒（RPV）有群特异性表位,主要是在F蛋白上,F蛋白存在高度的表位同源性,是异型免疫的主要交叉抗原，故可产生交叉免疫。目前研究认为犬瘟热病毒只有一个血清型。但由于CDV可能具有丰富的基因多样性,存在着不同的变异毒株。大量研究显示,目前流行的野毒株与标准的Covac、Rockborn、Onderstepoort、Lederle等疫苗株的抗原性、致细胞病变类型(CPE)、毒力等生物学特性方面存在部分差异。本病毒在-10℃可生存几个月，在-70℃或冻干条件下长期存活；在0℃以上感染力迅速丧失;最适PH7.0,对热和干燥敏感，0.1%甲醛或1%煤酚皂等对本病由消毒效果

流行病学传染源

患犬瘟热病动物、潜伏期带毒动物及病死尸体是主要的传染源。CDV为一种泛嗜性病毒，但亲嗜性最强的淋巴细胞和上皮细胞。CDV大量存在于感染和患病动物的唾液、眼和鼻分泌物中,也见于淋巴结、肝脏、脊髓、血液、脑脊液、心包液及胸腹水中。患犬瘟热的犬是最危险的传染源,许多报道显示多数养殖场发病与本场内或附近居民的患病犬有关,因此,毛皮动物养殖场如需要护场犬时,应对进行其定期免疫。患病痊愈动物带毒期可长达6个月,此间,仍可通过其排泄物和分泌物中排出病毒,污染周围环境。

传播途径试验表明，犬瘟热主要传播途径为通过消化道、呼吸道以及粘膜直接接触传播。若与病毒携带者直接接触,或接触污染的饮水、饲料、垫草、食具、用具、饲养人员的工作服、手套,兽医人员的体温计、注射器及注射针头等,均可感染此病。犬瘟热也可通过鼠类、禽类、吸血昆虫以及风等媒介作用间接传播。CDV还可通过胎盘进行垂直感染。二、发病机理与主要临床特征发病机理感染后病毒主要从鼻咽和呼吸道散布到支气管淋巴结和扁桃体进行原发性增值，产生初始毒血症，同时伴有第一次体温升高，此时病毒散播到网状内皮系统。在淋巴器官增殖的病毒被淋巴细胞及单核细胞携带进入血液，产生第二次病毒血症，伴有第二次体温升高。CD病例CBC可见WBC计数下降，后可因继发感染导致WBC升高。

临床症状与病变CDV为一种泛嗜性病毒（与机体细胞广泛存在CDV受体有关）病变分布广泛，但亲嗜性最强的淋巴细胞和上皮细胞。肺脏、肝、脾、骨髓、上皮细胞组织以及全身淋巴结和淋巴器官是病毒易于定居之所,病理上表现为呼吸道、肺部和消化道不同程度的卡他性炎症,重症病例肺部充血性水肿和坏死性支气管炎,肠系膜脱落,肠系膜淋巴结肿大。病理组织学检查,在呼吸道、膀胧、肾孟上皮细胞中可见到包涵体。临床上犬瘟热主要表现的症状：1.眼鼻有浆液性或脓性分泌物；2.呼吸道症状，如咳嗽、流鼻涕等；3.双向热；4.血便；5.神经症状，抽搐，角弓反张等。有些病例皮肤出现水疱性皮疹、有些病例鼻和脚底表皮角质层增生而呈角化病。CDV主要侵害易感动物的呼吸系统、消化系统以及神经系统。由于受动物免疫状态、野毒株毒力强弱差异等因素影响,感染CDV后动物临床症状不尽相同,在临床上可将犬瘟热分为呼吸型、消化型、神精型和混合型四种症候型,这四种症候型既可以独立出现,又可两种或三种混合在一起。此外犬瘟热的发生常与犬传染性肝炎、犬细小病毒及其他细菌感染并发或继发,使病情变得更为复杂。胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析技术是20世纪90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的检测技术,由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定，用于人的妊娠检查。近年来该技术发展迅速,在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。目前，胶体金技术广泛用于小动物传染病如：CDV、CPV、CAV（传染性肝炎）、CCV、FPV（猫泛白细胞减少症）、FeSV（猫白血病）、FIV（猫免疫缺陷病）等疾病的快速筛选诊断。

氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,它带负电而且疏水,由于静电作用金颗粒和水成为稳定的胶体状态称胶体金。胶体金标记技术,实质上是蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面带负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸引而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径,也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附能力,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。显微镜下金标蛋白结合物呈黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而目前金标被应用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。金标抗体金标抗体-抗原-抗体复合物抗金标抗体-金标抗体复合物（吸水玻璃纤维）包被抗体处玻璃纤维素膜吸水纸包被抗金标抗体处免疫胶体金抗体包被处RT-PCRRT-PCR

逆转录-聚合酶链式反应方法具有特异、敏感、快速诊断等优点。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的RAN作为模板，采用特异性引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达，再进行电泳检测。

如王凤雪,闫喜军等以CDV疫苗株N蛋白基因为研究对象,建立的CDV的RT-PCR检测方法用于毛皮动物犬瘟热诊断。

P1(5’GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA3’);P2(5’CTTGAGCTTTCGACCCTTC3’)

1.TRIzol法抽取总RNA

2.病毒cDNA的合成反转录(RT)20uL反转录反应体系：反转录引物P21uL、RNA5uL、70℃加热10min、冰浴10min，再加入5倍PCRbuffer4uL,2.5mmol/LdNTP2uL,RNAisn抑制酶0.5uL,AMV反转录酶1uL,DEPCH2O4.5uL,充分混合后离心,经42℃60min,95℃灭活AMV反转录酶,立即于冰上冷却,进入PCR。

3.PCR反应体系：PCR反转录产物5uL,10倍PCRbuffer5uL,2.5mmol/LdNTP4uL,上、下游引物各1uL,rTaqDNAPolymerase1uL,加水补足50uL。PCR的反应程序:94℃45s,51.6℃45s,72℃45s,35个循环后,72℃延伸5min。取10uLPCR产物,以100bpLadder作对照,进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。包涵体检查

可刮取鼻、舌、结膜、瞬膜或刮取膀胱、肾盂、胆囊和胆管等粘膜，做成涂片，干燥，甲醛固定，苏木紫和伊红染色后镜检。包涵体红色见以胞浆内，一个细胞内可能有1-10个，平均2-3个，椭圆形或圆形，边缘清晰。发现包涵体可以作为诊断依据，但要与细小病毒的核内包涵体区别。有时仅仅根据包涵体的存在可能导致假阳性诊断，最好还要进行病毒分离鉴定或血清学检查。CPVCDV血清学技术

血清中和试验：将备检血清稀释后加入标准病毒株，25℃作用2h，与制备好的犬肾或绿猴肾细胞悬液混合接种于微量培养板，5%CO2条件下35-36℃培养3d染色检查CPF。荧光抗体检查技术：急性病犬的淋巴细胞、结膜。阴道细胞、脑脊髓液涂片做荧光抗体染色，其阳性胞浆显示弥散性荧光。亚急性或慢性病犬由于产生中和抗体，通常难以查出阳性细胞。补体结合试验：多以CDV的Vero细胞或鸡胚成纤维细胞培养物为抗原，检查备检血清中的补体结合抗体。因该抗体出现于感染后2-3周，维持时间也短，所以只能作为一种证明近期感染的方法。母犬产仔后一个星期左右的乳汁叫初乳，初乳中的母源抗体水平较高，初生幼犬可以通过初乳获得对CDV的中和抗体，从而获得对CDV的抵抗力。值得注意的是母犬乳汁的抗体水平随时间下降而且幼仔对母源抗体的吸收能力也下降，随着幼犬消化系统的成熟，能产生分解免疫球蛋白的酶。临床应用的犬瘟疫苗主要是弱毒疫苗。影响CD弱毒疫苗免疫效果的因素较多，免疫的时机选择很重要，最理想的办法是根据母犬血清CD中和抗体水平与幼犬吃初乳的情况决定幼犬的首免日龄。1.幼犬母源抗体的半衰期为8.5天，多数幼犬母抗在12周龄减弱，15周龄全消失。血液中母抗滴度在1:100以下是免疫接种的提示滴度。抗体滴度不明的幼犬一般于6-9周龄进行首免，间隔2-3周在进行二免三免，以后每年加强免疫一次。为防止母源抗体对首免得干扰，可适当的增加首次或以后免疫的剂量和次数。2.未曾接种麻疹疫苗的易感犬，在接种犬瘟疫苗后经2-3周才能产生免疫力，这段时间幼犬对犬瘟热仍然有很高的易感性。试验研究表明，对于受CD威胁的刚断乳幼犬，可先注射麻