第三章-植物细胞工程123节

第三章植物细胞工程

PlantCellEngineering第一节细胞工程的基础知识与基本技术1.基础知识原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易于操作；但细胞壁为肽聚糖，表达真核基因受一定限制。真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁（纤维素和果胶）。植物细胞的结构特征植物细胞的亚显微结构

（质膜）洋葱表皮细胞显微结构细胞壁cellwall细胞核nucleus液泡vacuole细胞质Cytoplasm叶绿体Chloroplast动植物细胞区别

细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细胞没有。植物细胞是完整的,一个健全的植物细胞通过分化与增殖可发于成一株完整的植物,但动物细胞不可以。模式植物细胞构造

细胞壁胞间层初生壁次生壁后含物

原生质体贮藏物质晶体细胞膜细胞质细胞器细胞核模式植物细胞模式植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成质体线粒体液泡内质网核糖体高尔基体植物细胞全能性指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。离体培养之所以能够成功，首先是由于植物细胞具有全能性的缘故。一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。2.基本操作2.1无菌操作概念与技术无菌室布局、卫生、消毒、超净台第一节细胞工程的基础知识与基本技术无菌操作asepsis实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材的灭菌无菌接种消毒实验台卫生培养室培养(1)消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。(2)打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。(3)开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。(4)用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。(5)用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。(6)把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。(7)在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。(8)打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。(9)取下接种器械，在火焰上消毒。(10)把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。(11)接种结束后，清理和关闭超净工作台。取样灭菌培养传代收获除菌取样原生质体融合筛选鉴定2.基本操作2.1细胞培养技术第一节细胞工程的基础知识与基本技术2.3

细胞融合技术第二节植物细胞工程培养基及培养环境一、所需环境条件与自然条件一样，组织培养中的材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。温度光照湿度气体培养基的渗透压pH值植物材料一般最适温度在25±2℃之间环境条件最常用的光周期是光照16h，黑暗8h一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%—80%氧气是愈伤组织生长所必需的

调节渗透压常常从糖入手

植物组织培养时培养基的pH值大多在5.0—6.5二、营养成分植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等点化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。第二节植物细胞工程培养基及培养环境国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为※大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种※微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会的建议：所需浓度>0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓度<0.5mmol/L的元素为微量元素1、大量元素N:是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。

P:是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K:对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境Mg、S、Ca:是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S:是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca:是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。2、微量元素

在微量元素中，铁的使用最大：

◆一些氧化酶的组成成分

◆叶绿素形成的必要条件

◆使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境

硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系

铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长

锰参与植物的光合、呼吸代谢

钼参与氮素的代谢

氯是光合作用水光解的活化剂

微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境3、碳源碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：

◆具有热易变的性质◆利于吸收和利用

◆使用浓度一般在2%—5%

◆提供能源和调节渗透压二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境4、维生素类

◆以各种辅酶的形式存在◆参与多种代谢活动◆对生长，分化等有很好的促进作用◆主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素◆常用维生素有VB1和VB6

二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境5、肌醇◆环己六醇◆细胞壁的构建材料◆参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动◆促进活性物质发挥作用二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境6、氨基酸

◆蛋白质的组成成分

◆有机氮源

◆可直接被细胞吸收利用

◆培养基中常用的是甘氨酸二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境7、天然复合物

◆促进某些愈伤组织和器官的生长

◆化学成分不明、复杂

◆天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境8、琼脂

◆是使用最普遍的凝固剂◆用量一般在6—10g/L之间◆颜色以浅、透明度高好，洁净为上品

除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境9、活性炭

◆吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质

◆抑制外植体褐变

◆防止玻璃苗的产生

◆促进培养物生长和分化

◆促进生根缺点：

◆没有选择性10、抗生素

◆防止外植体内生菌造成的污染活性炭二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境11、生长素类

◆促进细胞伸长和分裂

◆促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实

◆诱导愈伤组织形成

◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好

◆常用的生长素：

IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境12、细胞分裂素类

◆促进细胞分裂和分化

◆诱导胚状体和不定芽的形成

◆延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成

◆用于离体成花的调控

◆溶于0.5—1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中

◆常用的细胞分裂素：

KT(激动素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境13、赤霉素类和脱落酸

A、赤霉素类

◆组织培养中不常使用

◆加速细胞的伸长生长

◆促进细胞的分裂

◆主要是GA3

B、脱落酸

◆抑制细胞分裂和伸长

◆促进脱落和衰老

◆促进休眠和提高抗逆能力二、营养成分第二节植物细胞工程培养基及培养环境◆培养基形态不同：固体培养基、液体培养基◆培养过程不同：初代培养基、继代培养基◆其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基

◆营养水平不同：基本培养基、完全培养基1、培养基的种类三、培养基的配制、灭菌与保存第二节植物细胞工程培养基及培养环境MS培养基:

◆无机盐浓度高◆高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐◆含有一定数量的铵盐◆营养丰富◆不需要添加更多的有机附加物2、几种常见培养基的特点第二节植物细胞工程培养基及培养环境三、培养基的配制、灭菌与保存White培养基

◆1943年由White为培养番茄根尖而设计

◆1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素

◆无机盐浓度较低◆使用广泛◆在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素含量微量元素含量铁盐含量有机物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0烟酸0.3琼脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3.0盐酸硫胺素0.1

NaH2PO44H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆辛0.1KCl65CuSO45H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培养基B5培养基

◆1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计

◆含有较低的铵盐

◆较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l)KNO3

2500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0烟酸1.0MnSO4·4H2O10盐酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激动素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025盐酸硫铵10Na2-EDTA37.3

B5培养基的组成和配方N6培养基

◆1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计

◆

KNO3和（NH4）SO4含量高，不含钼组成成分数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4盐酸硫铵1.0ZnSO4·7H2O1.5N6培养基组成及配方配制培养基应做好几点工作：（1）实验用具的准备。包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备(2)试剂、药品的准备(3)根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量3、培养基的配制具体操作如下：1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；2、根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀；3、加水定容至规定体积，搅拌均匀；4、调整培养基的pH值；5、分装；6、封口。组织培养必须在无菌环境中进行，因此培养基的灭菌操作非常重要。培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。一般采用的是高压蒸汽灭菌。4、培养基的灭菌

灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。◆灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。检验方法：将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。◆保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。◆保存时间不可过长。5、培养基的保存一、概述1.植物组织培养概念（concept）狭义概念：

指对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织（callus）进行培养直至生成完整植株。广义概念：无菌操作分离植物体一部分(即外植体)接种到培养基，在人工条件下培养直至生成完整植株。生物技术中的一个基本技术第三节植物组织培养愈伤组织〔callus〕:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。这种组织没有发生分化。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织才开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。胚轴花粉胚乳胚种子果实花器叶芽茎根组织原生质体子叶子房苞片胚珠花药花梗分生组织成熟组织花托叶柄幼苗2.植物组织培养的理论基础细胞全能性（totipotency）理论植物每一个具有完整细胞Totipotencyistheabilityofasinglecelltodivideandproduceallofthedifferentiatedcellsinanorganism的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。1958年Steward等人在以胡萝卜根组织为外植体的组织培养实验中，证实了细胞的全能性。3.相关名词分化〔differentiation〕细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。脱分化〔dedifferentiation〕已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。再分化〔redifferentiation〕脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。植物组织培养过程总结离体的植物器官、组织或细胞（外植体）离体的植物器官、组织或细胞（外植体）愈伤组织根、芽植物体脱分化再分化4.植物组织培养的特点（CharacteristicsofPlantTissueCultureTechniques）(1)培养条件可以人为加以控制

(2)繁殖系数大，培养周期短(3)管理方便，有利于实现工厂化生产和自动化控制5.组织培养发展历史

1902年Haberlandt首次进行离体细胞实验，发表了“植物离体细胞培养实验”报告；1934年White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，第一次器官培养；1939年White、Gautheret和Nobecourt愈伤组织培养实验成功，第一次进行细胞/组织培养；1957年Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，通过改变培养基中生长素和细胞分裂素这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化；

1958年Steward在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚；1960年Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法；繁殖系数高，迅速建立起“兰花工业”；1962年Murashige和Skoog为烟草组织培养建立了培养基，此培养基被证明适合大部分植物的组织培养，至今仍被广泛使用。自60年代以来，组织培养技术得到了飞速发展，特别是进30年来，迄今进行组培的植物已达3000多种，已从开始时的纯学术性研究，发展到今天有巨大应用价值的技术。离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化芽根植物体培养植物组培的基本过程Schemeofplanttissueculture二、植物组织培养的基本要求

1、植物组织培养的基本流程二、植物组织培养的基本要求

1、植物组织培养的基本流程植物组培的基本过程除菌与接种

自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗外植体

无菌滤纸吸干切割

无菌外植体小块外植体置培养基上培养起始培养

消毒剂使用浓度/%清除消毒时间/min灭菌效果次氯酸钠2容易5~30很好次氯酸钙9~10容易5~30很好漂白粉饱和溶液容易5~30很好升汞0.1~1较难2~10最好

酒精70~75容易0.2~2好过氧化氢10~12最容易5~15好溴水1~2容易2~10很好硝酸银1较难5~30好抗生素4~50mg/L中等30~60较好常用消毒剂的使用和效果

转移到温室大田移栽和生长组织培养实验室布局