双翅目昆虫抗菌肽的特点、作用机制及应用综述,昆虫学论文

双翅目昆虫抗菌肽的特点、作用机制及应用综述,昆虫学论文抗菌肽〔antimicrobialpeptides,AMPs〕原指昆虫体内经诱导产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，现泛指生物有机体在抵抗病原微生物侵染时所产生的一类具有防御性质的多肽，分子量在2000~7000,由20~60个氨基酸残基组成，通常具有正净电荷。抗菌肽多数有强碱性、热稳定性、广谱抗菌性等特点，能够抗真菌、细菌、病毒、原虫，抑制杀灭肿瘤细胞等。昆虫所具有的先天免疫防御系统有互相作用的细胞反响和体液反响[1],也有一些昆虫的免疫系统存在特异性，这种具有特异性的抗菌物质被称为抗菌肽。昆虫抗菌肽在1958年被当代科学家初次发现[2],但没有被具体描绘叙述，直到20世纪80年代瑞典科学家Bo-man等在惜古比天蚕〔Hyalophoracecropia〕的滞育蛹中初次分离到抗菌肽，人们先后在真菌、细菌、两栖类、昆虫、高等植物以及哺乳动物中发现了大量的抗菌肽[3].昆虫是华而不实最大的生物种群，其抗菌肽数量难以估量。仅在双翅目、鳞翅目、鞘翅目等8个目的昆虫中发现的昆虫抗菌肽类物质就超过200多种[4].当前国内外学者在肉蝇、绿蝇、果蝇、地中海实蝇、厩鳌蝇、家蝇等双翅目蝇类以及白纹伊蚊、埃及伊蚊、黑水虻等蚊类中都分离到了具有不同抗菌活性的抗菌肽，而仅在双翅目黑腹果蝇的血淋巴中就发现7种抗菌肽。近年来对抗菌肽或昆虫抗菌肽的综述很多，但还没有专门针对双翅目昆虫抗菌肽的综述。本文从双翅目昆虫抗菌肽的特点和种类、作用机制及应用三个方面进行综述，以期对双翅目昆虫抗菌肽的进一步研究和应用有指导作用。1抗菌肽的分类双翅目抗菌肽既有分子量比拟小的生物活性肽或者蛋白，又有分子量比拟大的溶菌酶，这些抗菌肽大多是带有正电荷的阳离子肽。阳离子抗菌肽的分类比拟松懈，在生物化学和构造的基础上，可将双翅目昆虫抗菌肽分为三组[5].1.1线性-螺旋抗菌肽一般来讲该类分子由29~42个氨基酸组成，分子内不含半胱氨酸，所以不能构成分子内二硫键，在C、N两端具有两性的螺旋构造，这有利于插入细胞膜，其C端多数酰胺化，这被以为与加强抗菌肽活性有关[3].线性-螺旋抗菌肽在双翅目昆虫中广泛存在，已先后从黑腹果蝇〔Dro-sophilamelanogaster〕、埃及伊蚊〔Aedesaegypti〕、冈比亚按蚊〔Anophelesgambiae〕、家蝇〔Muscado-mestica〕等中被分离出来。抗菌肽基因可在果蝇的不同发育历期表示出，并对不同的病原体做出反响[6].为了控制蚊媒疾病，线性-螺旋抗菌肽天蚕素A和防御素A基因已在转基因埃及伊蚊中过度表示出，证明此类抗菌肽能够完全阻止疟原虫的传播[7].来自于麻蝇〔Sarcophagidaeperegri-na〕的天蚕抗菌肽麻蝇素1A〔sarcotoxin1A〕,也是一种线性-螺旋抗菌肽，具有杀菌活性，华而不实革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌对其更敏感。1.2线性富含脯氨酸/甘氨酸的抗菌肽富含甘氨酸抗菌肽〔glycine-richantibacteri-alpeptides〕的C端有一个或两个富含甘氨酸的构造域---G构造域〔G-domain〕,而在抗菌肽N端富含脯氨酸构造域〔P-domain〕的，被称为富含脯氨酸的抗菌肽〔proline-richantibacterialpeptides〕[8].双翅目是富含脯氨酸/甘氨酸的抗菌肽的主要来源之一[3].家蝇抗菌肽MDL-3[9]、来自双翅目麻蝇属的麻蝇素Ⅲ〔sarcotoxinⅢ〕都是富含甘氨酸的抗菌肽[10].从双翅目中分离出的drosocin与pyrrhocoricin则是富含脯氨酸抗菌肽的代表，他们的序列类似，两者的AMPs均有一个苏氨酸残基以运载二糖基序，这可能是使其具有抗菌活性的重要位点[11].drosocin的主要活性是抵抗肠杆菌科家族的革兰氏阴性菌[12],pyrrhocoricin能有效杀死鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性菌[5].另外，从果蝇〔D.melanogaster〕中提取的抗菌肽Metchnikowin[13]、柳峰松等[8]通过RT-PCR和RACE技术克隆得到MdDpt基因〔Gen-Bankaccessionno:FJ794602〕的家蝇抗菌肽Dip-tericin也属富含脯氨酸的抗菌肽。1.3半胱氨酸稳定的抗菌肽半胱氨酸稳定的抗菌肽含33~46个氨基酸，均为小阳离子多肽，偶数的半胱氨酸残基构成3~4个二硫化物键，可稳定多肽分子。其二级构造包括一个和通过二硫键串联成的混合物。此类抗菌肽出如今大多数昆虫中，包括Sapecins〔麻蝇防御素〕、Phormicins、Royalisin、Spodopteri-cin、Gallerimycin、Heliomycin和Drosomycin〔果蝇抗菌肽〕,这些通常组合在一起统称为防御素。华而不实Sapecins和Drosomycin都属于双翅目昆虫抗菌肽，其主要活性是抵抗革兰氏阳性菌[14].很多防御素的抗菌作用及其抗霉菌病的发展潜力都是当前公认的[15],例如，Cho等[16]提出，根据棕尾别麻蝇〔Sarcophagaperegrina〕体内的Sapecin合成的短的抗菌肽KLKLLLLLKLK-NH2,在体内和体外都能强烈抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌〔MRSA〕.1.4其它还有一些不属于上述三类的双翅目昆虫抗菌肽，如丝光绿蝇〔Luciliasericata〕体内的Seraticin、红头绿蝇〔Calliphoravicina〕体内的Alloferoon1和Alloferoon2以及棕尾别麻蝇〔S.peregrina〕体内的外源凝集素Lectin[5]均已被提取出来，但其抗菌作用等需要进一步研究。2作用机制固然抗菌肽的研究已经持续了三十多年，一些先进的技术和手段如荧光染色、中子散射等也相继被应用到这个领域中来，但由于抗菌肽种类繁多，至今人们对抗菌肽的抗细菌作用机制还没有统一的定论。人们普遍以为，这些阳离子肽具有选择性地与带负电荷的细菌外表磷脂双分子层或者膜互相作用的趋势。除此之外，他们往往拥有近50%的疏水性残基。因而，这些肽表现出空间上分离的疏水性和亲水性的区域，利用两亲性质与膜产生作用[17],即阳离子肽通过静电与细菌外膜的阴离子结合，如革兰氏阴性细菌脂多糖的磷酸基团或者革兰氏阳性菌外表的脂磷壁酸[18].当前人们所认可的主流观点是：抗菌肽把细胞膜当做靶点，通过静电作用与细胞膜结合，然后在细胞膜上构成孔洞，进而引起细胞内容物泄漏，最终导致细胞死亡[3].双翅目昆虫抗菌肽在细胞膜上构成孔洞的作用经过能够用桶板模型、毯式模型和环桶模型[19~21]来解释，但以桶板模型和毯式模型为主，国内外很多研究已证实。2.1桶板模型在桶板模型中，螺旋形的抗菌肽簇嵌入细胞膜的磷脂双分子层就好像棍状物装入桶内构成横跨膜的小孔，AMPs亲水端排列在水分子孔隙，而AMPs的非极性端微生物与磷脂膜疏水端的脂肪酸相结合。例如，1998年，Dong等[22]初次从蚊类中发现了白纹伊蚊〔Aedesalbopictus〕天蚕素A〔CecropinA〕;之后，Lockey等利用电子显微镜、胶体金免疫技术观察到了CecropinA抗菌肽在大肠杆菌的细胞膜上构成一个直径为几纳米的孔洞，其细胞内容物由洞内向外泄漏导致细菌死亡；Juwadi等研究了cecropinA与蜂毒肽Melittin杂合肽的抗菌活性，结果显示抗菌肽与阴离子细胞膜的磷脂组分互相作用后，此杂合肽的-螺旋插进菌膜，在其外表聚合构成小孔，随即细胞内容物泄漏致使细菌死亡[3].侯利霞等[23]研究表示清楚，家蝇抗菌肽使细菌外表电负性增加，导致细菌细胞膜通透性增加，并因而揣测，此类抗菌肽的作用机制是使细胞膜构成孔洞。2.2毯式模型在毯式模型中，AMPs平行贴附在膜上成毯状，导致微生物外膜产生孔洞，并在临界浓度瓦解。宫霞等[24]研究结果表示清楚，因家蝇抗菌肽MDL-2分子量相对较小，常以聚合体的方式发挥作用，这样多个抗菌肽分子与膜结合，改变了膜的动态平衡，因而可能符合毯式模型作用机制。另外，Shai等[25]指出此模型还可描绘叙述一些天蚕素抗菌肽的作用方式。2.3环式模型在环形模型中，AMPs垂直插入膜排列，抗菌肽分子的极性头部和磷脂分子的极性头部结合，与磷脂双分子层一起构成孔洞[26],是此模型区别于前两种模型的地方[3].2.4其它除此之外，很多研究者发现抗菌肽还可通过下面途径来发挥抗菌作用：如抗菌肽作用于细菌线粒体膜，毁坏线粒体膜的构造，如使膜肿胀、空泡化、嵴消失、排列不规则，细菌由于丧失呼吸活性导致死亡；抗菌肽还能够通过抑制细菌的细胞壁合成，致使细菌细胞壁穿孔，导致细胞死亡；还能通过干扰细胞的外膜蛋