生理试验方法汇总

本文格式为Word版，下载可任意编辑——生理试验方法汇总（一）生理测定

1.叶绿素含量测定

测定方法：乙醇提取法；1.原理

叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a、b在652nm波优点有一致的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a、b的总量。2.材料、仪器设备及试剂

材料：小麦叶片。试剂：80﹪乙醇。

仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管；试管架；玻棒等。3.试验步骤（1）叶绿素的提取

从植株上选取有代表性的叶片数张，用打孔器打孔或剪碎后混匀（除去粗大叶脉），快速称取0.2g(可视样品叶绿素含量高低而增减用量)，置于25ml刻度试管中，加80﹪乙醇10ml左右，加塞放入60～80℃水浴中保温提取叶绿素并摇动，快速提取20分钟—60分钟（或常温下放在暗处浸提12～24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，用80﹪乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。（2）测定

取光径为1cm的比色杯，参与叶绿素提取液距比色杯口1cm处，以80﹪乙醇作为对照，于652nm波长下测定吸光度（A）值。（3）计算

将测得的吸光度A652值代入公式(1),即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg·g1Fw）。

－

A652

C(mg·ml1)=————……………………（1）

－

34.5

公式中：C—叶绿素（a和b）的总浓度(mg·ml1)

－

A652—表示在652nm波长下测得叶绿素提取液的吸光度

34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm,样品浓

度为1g·L

－1

时的吸光度）。

C（mg·ml1）×提取液总量（ml）

－

叶绿素含量（mg·g1Fw）=————————————————……（2）

－样品鲜重（g）

一、目的

把握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。二、原理

叶绿素a、b分别在663nm和645nm、470nm波优点有最大的吸收峰，同时在该波优点叶绿素a.、

b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：

A663=82.04Ca+9.27Cb……(1)A645=16.75Ca+45.6Cb……(2)

（1）、（2）式中的A663.A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。Ca、、Cb为叶绿素a、b的浓度，单位为mg·L－1。82.04、9.27为叶绿素a、b在波长663nm下的比吸收系数。16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm下的比吸收系数。解（1）、(2)式联立方程，得：

Ca=12.70A663–2.69A645……(3)Cb=22.9A645–4.68A663……(4)CT=Ca+Cb=20.21A645+8.02A663……(5)

Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度,CT为总叶绿素浓度，单位：（mg·L－1），.利用上面(3)、（4）、（5）式可以分别计算出叶绿素a、b及总叶绿素浓度。四、试验步骤

取光径为1cm的比色杯，参与叶绿素提取液距比色杯口1cm处，以80﹪乙醇作为对照，分别于663nm及645nm波长下测定吸光度（A）值。五、结果计算

将测定得到的吸光度A663、A645值分别代入上面(3)、(4)、（5）式计算出Ca、Cb及CT(即叶绿素a、b及叶绿素总量浓度)。再按下式计算出叶绿素a、b及叶绿素总含量。

Ca×提取液总量(ml)

叶绿素a含量（mg·g－1Fw）=—————————————样品鲜重（g）×1000

Cb×提取液总量(ml)

叶绿素b含量（mg·g－1Fw）=————————————－

样品鲜重（g）×1000CT×提取液总量(ml)

叶绿素总含量（mg·g－1Fw）=————————————－

样品鲜重（g）×1000

最终计算出叶绿素a/叶绿素b的比值，并加以分析。

2.可溶性糖含量测定

测定方法：蒽酮比色法1.原理

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（由于反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的状况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去大量麻烦，因此，有特别的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣参与反应液中，不然会由于细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620nm，故在此波长下进行比色。这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30ug左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的状况下，采用这一方法比较适合。2.材料、仪器设备及试剂材料：小麦分蘖节。

仪器设备：分光光度计；电子天平；三角瓶；大管；试管架；漏斗；容量瓶；试管；水浴锅试剂：1.浓硫酸。

2.葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：确凿称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）。

3.蒽酮试剂：称取0.1g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，80%硫酸溶液由76mL浓硫酸（比重1.84）稀释成100mL而成，把浓硫酸缓缓参与到蒸馏水中）100mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。3.试验步骤

（1）标准曲线制作

取6支大试管，从0-5分别编号，按下表参与各试剂。快速摇动混匀后，一起浸于沸水浴中，确凿煮沸10分钟取出，用流水冷却，室温放置10分钟，在620nm波长下比色。用空白调零测定光密度，以标准葡萄糖含量（μg）作横坐标，以吸光值作纵坐标作标准曲线。

表1蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量

试剂100μg/mL葡萄糖溶液（mL）蒸馏水（mL）蒽酮试剂（mL）葡萄糖量（μg）

（2）植物样品中可溶性糖的提取

将小麦分蘖节剪碎至2mm以下，称取剪碎混匀的新鲜样品0.5-1.0g,（或干样粉末5-100mg），放入大试管中，参与15mL蒸馏水，在沸水浴中加热20min，取出冷却过滤到100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定溶至刻度。（3）测定

取待测样品提取液0.1mL，加蒸馏水0.9mL，蒽酮试剂5mL，同以上操作显色测定光密度重复3次。4.结果处理

可溶性糖含量（%）=(C×VT)/(W×V1×106)×100式中：C从标准曲线差的葡糖量，μg；

VT样品提取液总体积，mL；V1显色时取样品液量，mL；W样品重（g）。

5.本卷须知

（1）、该显色反应十分灵敏，溶液中切勿混入纸屑及尘埃。（2）、蒽酮试剂含有浓硫酸，使用时应当防备。

管号001.05.0010.20.85.02020.40.65.04030.60.45.06040.80.25.08051.005.0100

3.可溶性蛋白测定

测定方法：考马斯亮蓝G—250染色法一、原理

考马斯亮蓝G–250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，浮现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。二、试验材料、试剂与仪器设备（一）试验材料植物材料。

（二）试剂1.标准蛋白质溶液（100μg／mL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白100mg，加水溶解并定容至100mL，配成1000μg／mL的母液；使用时取出10mL再稀释10倍（100μg/mL）;

2.考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，参与100mL85％（W／V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月;

3.90％乙醇;4.85％的磷酸。

（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。三、试验步骤1.标准曲线的绘制

（1）0~100μg／mL蛋白质标准曲线的制作

表2绘制标准曲线的各试剂参与量

管号001.00010.200.802020.400.604030.600.406040.800.208051.000100试剂标准蛋白质（mL）蒸馏水量（mL）蛋白质含量（μg）

取6支试管，按表2参与试剂，摇匀，向各管中参与5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）0~1000μg／mL蛋白质标准曲线的制作

表3绘制标准曲线的各试剂参与量

管号001.00010.200.8020020.400.6040030.600.4060040.800.2080051.0001000试剂蛋白质母液（mL）蒸馏水量（mL）蛋白质含量（μg）另取6支试管，按表3参与试剂，与步骤（1）一致，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2.样品测定

（1）样品提取称取鲜样0.25～0.5g，参与2mL蒸馏水和少许石英砂研磨成匀浆后，分次洗涤收集在同一离心管中，4000r/min离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶中，以蒸馏水定容至10mL，摇匀后待测。

（2）吸取样品提取液1mL（视蛋白质含量适当稀释），放入具塞刻度试管中（每个样品重复2次），参与5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。四、结果计算

（mg/g）

式中：C——查标准曲线值，μg；

VT——提取液总体积，mL；WF——样品鲜重，g；VS——测定时加样量，mL。

4.游离脯氨酸含量测定

测定方法：酸性茚三酮法

用磺基水杨酸提取法测定脯氨酸含量不受样品状态的限制。当处理大批量样品或采样后不能马上分析时，可先烘干待测。一、目的

在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

二、原理

磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

三、材料、仪器及试剂

1.材料：植物叶片。

2.仪器：分光光度计；电子分析天平；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。3.试剂及配制：

(1)2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将2.5g茚三酮放入烧杯，参与60ml冰乙酸和40ml6mol·L酸中，搅拌加热（70℃）溶解，棕色瓶4℃贮于冰箱中。

(2)3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

(3)10μg·ml脯氨酸标准母液配制：确切称取10mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，为100μg·ml

－1

-1

－1

磷

脯氨酸母液。再吸取该溶液10ml,

加蒸馏水稀释定容至100ml,即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。(4)冰醋酸；(5)甲苯。

四、试验步骤

1.脯氨酸标准曲线的制作

（1）取7支试管，编号，按下表配制每管含量为0～20μg的脯氨酸标准液。

参与表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再参与4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

管号试剂10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml）蒸馏水（ml）冰乙酸（ml）2.5﹪酸性茚三酮（ml）每管脯氨酸含量（μg）00222010.21.822220.41.622430.81.222841.20.8221251.60.4221662.002220（2）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520nm波优点测定吸光度（A）值。

（3）以0～6号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的测定（1）脯氨酸的提取

称取不同处理的植物叶片0.2~0.5g（干样根据水分含量酌减），剪碎后放入具塞试管中，然后向各管分别参与5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于清白的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液，也可直接吸取提取清液测定。（2）测定

吸取2ml提取液于带玻塞试管中，参与2ml冰乙酸及3ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后参与4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻。

用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波优点测定吸光度（A）值。

五、计算结果

从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：X×提取液总量（ml）

脯氨酸含量（μg·g1Fw）＝———————————————————

－

样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）

公式中：X－从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）

六、本卷须知

静置分层明了后才可比色。

5.根系活力测定

测定方法：TTC法测定

一、原理

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲（TTF），生成的三苯甲（TTF）比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因参与琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到加强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。二、试验材料、试剂与仪器设备（一）试验材料

水培或砂培小麦、玉米等植物根系。（二）试剂

1.乙酸乙酯（分析纯）。

2.次硫酸钠（Na2S2O4，分析纯），粉末。

3.1％TTC溶液：确凿称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100mL。用时稀释至需要的浓度。

4.磷酸缓冲液（1/15mol/L，pH7.0）。Na2HPO4·2H2O分子量=178.05，1/15M溶液为11.876克/升。KH2PO4分子量=136.09，1/15M溶液为9.078克/升。然后6:4混合。

5.1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55mL，边搅拌边参与盛有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000mL。

6.0.4mol/L琥珀酸：称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100mL即成。（三）仪器设备

小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支，刻度试管6支，分光光度计，分析天平（感量0.1mg），电子顶载天平（感量0.1g），温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。三、试验步骤1.定性测定

（1）配制反应液把1％TTC溶液、0.4mol／L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。

（2）把根细心洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1～3h，以观测着色状况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，说明该处有脱氢酶存在。

2.定量测定

（1）TTC标准曲线的制作

取0.4％TTC溶液0.2mL放入大试管中，加9.8mL乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则马上产生红色的TTF。此溶液浓度为每毫升含有TTF80μg。分别取此溶液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置10mL刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，参与0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各5mL，使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～2h，此后马上参与1mol/L硫酸2mL，以中止反应。（与此同时做一空白试验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。

（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3～4mL和少量石英砂，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，皆移入刻度试管，最终加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还原量。四、结果计算

根系活力=C/(1000*W*h)mgTTF/（g·h）式中：C——四氮唑还原量，μg。

W——根重，g。h——时间，h。

6．SOD活性测定

测定方法：NBT光化还原法

一、试验原理

氧物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O2-）的酶，它催化以下反应：2O2-+2H+→H2O2+O2

反应产物H2O2可由过氧化化氢酶进一步分解或被氧化物酶利用。

本试验依据超氧化歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，O2-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SODO2-可清除，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料小麦叶片（二）仪器设备

高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，光照箱（反应试管处照度为4000lx，或40umolm-2s-1），试管或指形管数支。（三）试剂

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（Ph7.8）。甲液：0.2mol·L1

－

母液取磷酸氢二钠7.1628g，加水溶解，并稀释至100ml。乙液：0.2mol·L1母液取磷酸二氢钠3.12g，加水溶解，并稀释至100ml。取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合，摇匀，即得。

（2）130mol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。4℃冰箱中保存可用1～2d。

（3）750mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。4℃冰箱中保存可用2～3d。

（4）100umol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。（5）20umol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、试验步骤

1、酶液提取

取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5~2ml于4℃10000r/min下离心20min，上清液即为SOD提液。

2、显色反应

取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表参与各溶液：

试剂（酶）0.05mol/L磷酸缓冲液130mol/Lmet溶液750umol/LNBT溶液100umol/LEDTA-Na2液20umol/L核黄素酶液蒸馏水总体积用量/ml1.50.30.30.30.300.050.253.0终浓度/比色时13mol/L75umol/L10umol/L2.0umol/L2支对照管以缓冲液代替酶液混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于25℃4000lx日光下反应20min(要求各管受光状况一致，温度高，时间缩短，低时延长)。3、SOD活性测定计算

至反应终止后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。四、结果计算

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性=

(Ack?AE)?V

1?ACK?W?Vt2SOD总活性

蛋白质含量SOD比活力=

式中：SOD总活性以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位·每毫克蛋白表示Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积，ml；Vt为测定时样品用量，ml；W为样鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。

7．MDA含量测定

测定方法：硫代巴比妥酸（TBA）显色法

一、原理

丙二醛（MDA）是由于植物官衰弱或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰弱及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，寻常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭遇干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波优点尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，寻常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，参与Fe3的终浓度为0.5nmol·L－1。在532nm、600nm

＋

和450nm波优点测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。二、材料、仪器设备及试剂

1.材料：植物叶片。

2.仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。

3.试剂：10％三氯乙酸溶液：称取10g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取0.6g代巴比妥酸，用10％三氯乙酸溶解，定容至100ml。三、试验步骤

1.丙二醛的提取

称取受低温等逆境胁迫的植物叶片1g，参与少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。

2.显色反应及测定

取2支清白试管，参与提取液2ml（对照管加蒸馏水2ml），然后各管再参与2ml0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心10min。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。四、丙二醛含量计算：

由于蔗糖－TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4×10－3，MDA－TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4×10－3和155×10－3。532nm非特异性吸光值可以600nm波优点的吸光值代表。

按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。方程组：

－

A450=（85.4×103）·C糖

－－

（A532－A600）=（155×103）·CMDA+（7.4×103）·C糖解得：

A450

－

C糖=——————=11.71A450（mmol·L1）

－

85.4×103

－

CMDA=6.45（A532－A600）－0.56A450（μmol·L1）

公式中：A450—在450nm波长下测得的吸光度值A532—在532nm波长下测得的吸光度值A600—在600nm波长下测得的吸光度值＊—1.55×105为摩尔比吸收系数

C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。1．按下式计算提取液中MDA浓度反应液体积（ml）CMDA×—————————1000

－

提取液中MDA浓度（μmol·ml1）=———————————————测定时提取液用量（ml）

2.按下式计算样品中MDA含量