慢病毒大规模制备下游工艺解决方案

———慢病毒大规模制备下游工艺解决方案

慢病毒

图1：慢病毒作用机制（来源和元生物）

慢病毒的英文是Lentivirus，它的命名有两层意思，一方面Lenti-在拉丁文中有慢的意思；另一方面慢病毒感染患者早期很难观察，大多都会经历一个长达数年的潜伏期，之后会缓慢发病，因此这些病原微生物被称之为慢病毒。它是逆转录病毒科下的一个属，其主要包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以巨噬细胞和淋巴细胞为主，最终导致感染个体发病。慢病毒的基因组都很复杂，编码一系列不同于其他逆转录病毒的调控蛋白，这使得它们具有独特的调控途径和病毒持久性机制。逆转录病毒家族包括致癌病毒（RNA肿瘤病毒）、狼疮病毒以及慢病毒，这三个子家族的成员都能感染人类。慢病毒通常与免疫系统和中枢神经系统的慢性疾病有关，如人类免疫缺陷病毒（HIV）会导致艾滋病，HTLV和HIV会导致神经障碍。1904年第一个慢病毒被分离出来的，它是从一匹得了溶血性贫血的马中得到，所以被命名为马传染性贫血病毒（EIAV）。从那时起，相关的慢病毒陆续从其他的物种中被分离，如猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）以及灵长类免疫缺陷病毒（SIV）等。慢病毒常规应用

慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，体外进行细胞功能学实验，包括细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等研究。稳定表达目的基因的肿瘤细胞株还可以进一步构建肿瘤动物模型，进行体内基因功能验证，药效药代，活体成像等检测，进一步研究体内肿瘤发生、发展和转移及药物治疗的效果。常见MOI列表

细胞名中文名称慢病毒感染MOI

（参考值）MGC80-3人胃癌细胞10HT-29人结肠癌细胞20RKO人结肠腺癌细胞10Caki-1人肾透明细胞癌皮肤转移细胞105637人膀胱癌细胞10U-118MG人脑星形胶质母细胞瘤10RWPE-1人正常前列腺上皮细胞20HeLa人宫颈癌细胞10~20CaSki人宫颈癌肠转移细胞10MCF7[MCF-7]人乳腺癌细胞10A549人非小细胞肺癌细胞10NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞20U-87MG人脑星形胶质母细胞瘤10U251人胶质瘤细胞10A172人胶质母细胞瘤细胞10K-562人慢性髓原白血病细胞10HL-60人原髓细胞白血病细胞10GES-1人胃上皮细胞20U266人骨髓瘤细胞20CAL27人舌鳞癌细胞20PC9人肺癌细胞5PC14人肺癌细胞10MADB-106大鼠乳腺癌细胞20F98大鼠脑胶质瘤细胞20MHCC-97H人肝癌细胞（高转移）10~20

MOI是multiplicityofinfection的缩写，即感染复数，其含义是感染时病毒与细胞的数量比值，一般以实验中某个细胞，感染达到80%，定义为这个细胞的MOI值，即病毒量与细胞数的比值；加的病毒量(l)=细胞数MOI/滴度(/ml)1000（注：本段内容选自和元生物管网）慢病毒的理化性质

慢病毒虽然属于逆转录病毒科的一种，但其结构和基因组的复杂程度远超其他逆转录病毒。这也使得慢病毒具有独特的整合机制和病毒感染持久性。慢病毒整体大小约100nm，在病毒载体中属于体积较大类型。其包装容量一般在4.5-5kb左右，能够满足一般的细胞治疗需求。慢病毒检测方法

在293T细胞株中对纯化的慢病毒进行滴度测定，常用有4种方法进行慢病毒滴度测定，分别是：

通过ELISA对病毒颗粒中的p24蛋白进行检测;

通过定量PCR对病毒颗粒的RNA进行检查;

通过定量PCR对整合到基因组DNA中的病毒序列进行检测；

通过FACS对荧光蛋白的表达水平进行检测。但前两种方法并不能区分病毒颗粒是否有活性，因此测定所得的滴度往往比后两种方法高一至两个数量级。后两种方法测定的是有效的病毒滴度，因此更有意义。由于并非所有的病毒载体中都含有荧光蛋白，此外，荧光蛋白的表达有时候还受启动子及表达的目的基因影响，因此过定量PCR对整合到基因组DNA中的病毒序列进行检测是最佳方法。慢病毒下游工艺解决方案

1.澄清的病毒溶液经核酸酶孵育，核酸酶将宿主细胞核酸讲降解成小片段，且降低粘度。

2.核酸酶处理后的病毒溶液用300-750KD的膜组件进行切向流过滤伴随置换缓冲液，调整病毒粒子的浓度且使病毒溶液适用于下游分离纯化。

3.澄清好的病毒溶液用高刚性琼脂糖微球阴离子交换介质QLargeScaleHP吸附洗脱模式纯化并浓缩。

4.经阴离子交换（QLargeScaleHP）纯化后病毒溶液在用SeplifeSuncore700多模式层析介质进行粗纯，小于700KD的痕量HCP,HCD等物质进入多模式介质的活性内核区域，和介质以静电力，疏水作用，范德华力等结合，而慢病毒由于分子尺寸大，被排阻在介质的惰性层以外流穿而过，从而实现分离。同时也可用凝胶过滤层析Seplife4FF流穿模式去除痕量的杂质。

5.层析纯化后，在经超滤过程调整病毒粒子浓度及置换后续工序适合的缓冲液。

6.最后用0.22um的膜组件除菌过滤。更多关于慢病毒下游工艺解决方案的信息请联系苏州蓝晓生物。图：壳层技术多模式层析介质结构示意图（蓝晓科技）

注意事项：

每一步工序后，在开始下一步工序都要考虑病毒粒子浓度及缓冲液体系的匹