溴氨酸降解细菌的分离鉴定及特性

溴氨酸降解细菌的分离鉴定及特性研究摘要：从山东招远化工厂溴氨酸生产车间的污泥中分离得到一株溴氨酸降解菌QYY，它能够以溴氨酸为唯一碳、氮及能源生长。经形态和生理生化鉴定，该菌株为鞘氨醇单胞菌属。通过PCR扩增该菌株的核糖体小亚基（16SrRNA）基因，得到长度为1481bp的DNA片断，经序列分析表明，该菌株的16SrRNA核苷酸序列与鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonasxenophaga）的同源性为99%。在细菌系统发育分类学上，菌株QYY归属于变形细菌α亚类，鞘氨醇单胞菌属xenophaga菌种。确定该菌株的最适降解与生长条件分别为：PH6.0-7.0，T30℃，转速150rmin-1，接种量10%，该菌株在唯一碳、氮源培养基中可耐受的溴氨酸浓度为1000mgl-1。关键词：溴氨酸鞘氨醇单胞菌核糖体小亚基生物降解Isolation,identificationanddegradationcharacteristicsof1-amino-4-bromoanthraquinone-2-sulfonicacid-degradingbacteriaAbstract:AstrainQYYbeingcapableofdegrading1-amino-4-bromoanthraquinone-2-sulfonicacid(ABAS)wasisolatedfromthesludgeofABASproducingworkshopofZhaoyuanChemicalPlant,Shandongprovince,whichcangrowwithABASasthesolesourceofcarbon,nitrogenandenergy.ThestrainbelongstoSphingomonasbasedonmorphologicalandphysio-biochemicalidentification.A1481bp16SrDNAfragmentwasamplifiedfromtotalDNAofstrainQYYbyPCR.ThesequenceanalysisshowedstrainQYYshared99%homologywithSphingomonasxenophaga.Inphylogeneticframeworkofbacterialclassification,QYYbelongstoproteobacteria:alphasubdivision:Sphingomonasxenophaga.TheoptimaldegradationandgrowthconditionsofQYYwereasfollows:pH6.5,T30℃,speedofshaking150rmin-1andinoculationamount10%.ThestrainQYYcantolerate1000mgl-1ABASasthesolesourceofcarbon,nitrogenandenergy.Keywords:1-amino-4-bromoanthraquinone-2-sulfonicacid;Sphingomonas;16SrRNA;biodegradation溴氨酸是一种重要的蒽醌染料中间体，广泛存在于印染、纺织等生产废水中，使得这些废水带有一定色度,给水体造成不同程度的污染[1,2]。因此，如何去除这类废水的色度，引起国内外学者的关注。研究表明，微生物对染料脱色、降解有着显著的作用[3-5]。本文报道了从溴氨酸生产车间污泥中分离出的一株溴氨酸降解菌，该菌株能够以溴氨酸为唯一碳、氮源生长，对其进行了生理生化和形态学鉴定以及16SrDNA的序列分析，并对该菌株生长与降解的基本特性进行了研究。1材料和方法1.1样品来源及降解菌的分离与纯化分离样品来自山东招远化工总厂溴氨酸生产车间排污口的污泥。采用一次性投加高浓度化合物的驯化方法，从其中分离出溴氨酸混合降解菌。在此基础上，不断减少培养基中氮源的含量，得到可以溴氨酸为唯一碳、氮源生长的菌株，经反复平板涂布，最后选出一株具有高效降解能力的菌株，包藏在斜面唯一碳、氮源培养基上。1.2培养基富集培养基采用LB培养基[6]：蛋白胨10gl-1，酵母膏10gl-1，NaCl5gl-1菌种筛选培养基[7]：(NH4)2SO42gl-1,KH2PO42gl-1，Na2HPO41.3gl-1，FeCl31mll-1。唯一碳、氮源培养基采用含一定浓度溴氨酸的无机盐培养基[8]：KH2PO42gl-1，Na2HPO4，1.3gl-1，FeCl31mll-1。1.3试剂实验用溴氨酸（1-氨基-4-溴蒽醌-2-磺酸）从浙江东港工贸集团公司购入，分子量为382.19，结构式如图1所示：图1溴氨酸结构式1.4菌生长量与溴氨酸含量的测定菌体生长量和溴氨酸浓度可通过JASCOUV-560紫外－可见分光光度计(Japan，JASCO)，进行测定。其中菌生长浊度在660nm下测定，溴氨酸的吸光度在其特征吸收峰485nm下测定。豪1焦.5筑生理生化及形菠态鉴定父S.xen袄ophaga吼QYY纪的生理生化鉴辆定由中国科学所院微生物研究须所完成钳。景在扫描电镜幕(Japa凤n欺，冻JEM-12寨00EX)循下观察爷S.xen呀ophaga旗QYY俩的形态舍，料放大倍数为颤10000耗倍。享1苦.6欲细菌总披DNA警的提取疏细菌总虽DNA坊采用溶菌酶占-SDS-这蛋白酶博K滥的方法进行提然取盗[9]颂。密1届.7PCR忠扩增、反应产原物的纯化及克班隆朋PCR蛇引物采用细菌惜16SrD罩NA仇的通用引物洲F8密(谁5协’柴-AGAG矛TTTGA笔TCAT妻GGCTC延AG-3弃’扎)蓝和攻R1522租(梁5众’善-AAGG视ACGTC回ATCC蜡AGCCG咽CA-3侦’扇）。惠用睛PC泄R肤仪碑（场GeneAm逮p,PCR害Syste团m970百0雄）研进行扩增反应爹。反应体系总衫体积溉为代25µ字l裤：超纯允水馅16.2µ株l骗，友1义0血х由Buffer摊2.5µl箭,dNTP笼2µl,F旦8恼引拖物探1µ回l饥，怨R2菠2佩引户物花1µ暴l圈，吨ExTa建q炕酶决0.3µ舰l进，尸总怀DN俊A晒作一定稀释后狱取炸2µ傲l毁于反应体系中乳。外9续4蜡℃虏预变唱性季5min,饱姨经讽过旁3吹0拿个循环，其中肆，爬9菠8城℃埋变但性放20s,5庸5性℃辽退稳火丈40戒s剥，叼7盼2他℃饶延其伸郑1.5min脖,3岭0丙个循环后再扔在贷7跑2找℃司延澡伸渴7min,1将%它琼脂糖凝胶电胸泳宜，掠E侧B默染色后紫外检菌测。堆用绢Takar唤a汗琼脂糖凝胶纯走化试剂盒切胶后回扭收芝PC郊R忽产物，昏将子PC宫R虎产物克隆火到逝pGEM-屈T办载体上，转化讲大肠杆菌感受裙态细胞。瘦1法.816S洒rDNA把的测序和同源美性比较叼16SrD巧NA森的测序工作由将大连宝生物公趁司完成，将扩椅得的长度为龄1481bp微的序列用磁BLAST末软件与优Genban缺k辜中的扮16SrD馅NA寿序列进行同源户比较。惧1添.9闸生长与降解特挣性试验村在富集培养基棋中，加丽入势100mg臭/登l庭的溴氨酸，分牲别考察不流同宽p倒H至、兰T那、接种量以及赌摇床转速对溴奸氨酸降解及菌酒株生长的影响黎，进而确定最浇佳的生长与降洒解条件。项在唯一碳氮源借培养基中，分粮别加入不同浓生度的溴氨酸，询在最佳降解条终件下，考察菌识株对不同浓度柜溴氨酸的降解远情况及对溴氨茄酸的耐受性。2结果与讨论膛2锄.1晋S顽.煮xenop通haga叛QYY羊的朗分离与生理生西化及形态学鉴朝定朵通过多次驯化稼，分离得到一仙株能够以溴氨当酸为唯一碳、附氮源生长的菌叫株，命名为击QYY组。该菌株侍革兰氏染色阴谷性，无鞭毛，赞细胞为黄色，涨接触酶、氧化蛋酶阳性，肆表旨1警列出了鸡S鞭.总xenop割haga雀QYY钞的生理生化指尿标，依据伯杰笼细菌鉴定手册辜，将该菌鉴定均到鞘氨醇单胞诸菌属。孙该菌种由中国拆微生物菌种保房藏中心保存，狮入册日期俱为远200维4指年旗6嚼月饮1朽日，编号为坛CGMCC肚No.117敬2篇。们表喂1转溴氨酸降解菌让株思Sphing买omonas趋xenop朱haga急QYY盐的生理生化特绣性子试验项目骄玻涌边结果询试验项目沿屈岭堤结果牙试验项目狡错结果档试验项目月乎结果然革兰氏染色洲扭喊阴性度细胞形状舍销爷寒杆状稻鞭吃互毛促缩允无材与氧的关系纸汗毕好氧均细胞颜色睬雀径黄色嚼接触酶宰湾鸣+沟氧化酶轿固惯+姥产生荧光色素红端-哨产生果聚糖渗丢-撒产生脓青素抖蓝-仍水解七叶灵户摸+碍水解明胶猴踩-咸硝酸盐还原伶狗-售利用柠檬酸盐拉粗-锤利用丙二酸盐谅楚-壮精氨酸双水解大酶算-为反硝化旬庄鞭-思积累补PHB个搅赚开-仗41拨℃恰生长坏攀-位4羡℃粉生长总沟-宋O/F商试验龟慰洋氧化捞葡萄糖产酸邻俱+染利用唯一碳源右生长淹葡萄糖严陵+跌果裁反糖碌降-闯海藻糖动日-坐L-摔缬氨酸盐傲-都β脑-嚷丙氨酸妈串-清DL-匆精氨酸豆至-嫁乙酸盐开资-炊甘露醇斑珍-锈木绪漂糖驰流-奴阿拉伯糖点搭+哀鼠李糖介咸-患甘露糖敌馅-盲半乳糖偏叶+狂蔗衬仇糖览固-京丙酸盐俭漫-亏山梨醇压玻-夹麦芽糖粥逼+狼D-少酒石酸盐析-嗓亮氨酸雕牵+丘乳辜追糖它程-沸L-引组氨酸样浓-需L-窄色氨酸股般-得α遵-垦酮戊二酸盐徐-含苯乙酸盐采霞-梢该菌在固体培辈养基上呈圆形室，边缘整齐，愉表面干涩，菌弓体呈现土黄色妥，极易挑起。扎在高倍扫描电青镜下可观测到丧，般该菌株细胞为座杆状，菌体细蔑胞较小，为恭(协0.触3父-0.4吴)旅μ院m丈轿х维(下)懂μ列m推，驶如北图畏2袜所示：叨图壮2杀Sphing炒omonas桨xenop具haga塑QYY恩扫描电镜签（塘10000泻倍渐）炼2转.2纹S衔.截xenop督haga女QYY陶16SrD耻NA奸的序列分析浸将日S疑.岛xenop个haga乞QYY袍菌株的测序结铲果输入嗓GenBan政k太，束并用怪BLAST帜软件进行同源画性比较上，倡结果显示出该衰菌株与鞘氨醇偏单胞菌的多种鹿细菌具有较高缺的同源性使（闻大于蔽95%辆），弦如汗：貌与眯Sphing探omonas肾pauci魂mobili斯s捆同源性为免95%民，与拖Sphing旧omonas象yanoi厌kuyae暖的同源性在惭95-96%雹之间鹿，省其中与忌Sphing盗omonas状xenop话haga萄的同源性高达邀99%坝。通常认为，妻16SrD思NA街序列同源性小魄于虫98%吹是同属不同种虎，而同源性小族于毕93%-95恰%咸则为不同属梁[10]壮。因此，该菌修株可归属与鞘津氨醇单胞菌属屿（唐Sphing婶omonas副xenop毙haga瑞），在系统分扒类学上属于变扯型细菌姐α即亚类。该菌株谁在伪GenBan勾k伤中的序列登陆拌号为殃AY6117自16驼。繁3.3快温度及楼pH俩值对溴氨酸降悬解及菌株生长足的影响敬由棒图领3损和争图煌4慕可以看出严，爆p咱H醉和温度不仅影陷响着后S禾.渗xenop伴haga笑QYY傅的生长，同时歌也影响着溴氨虑酸的降解率。总在捉p命H芳小削于桨6.半0狂或是大编于习7.取0裁时，无论是菌声体的生长还是车溴氨酸的降解岩都受到不同程第度上的抑制。钥在擦pH6.0限-7.怪0庄之间，菌体的你生长和溴氨酸镰的降解率都出智现了最大值，誓从脾图恼3伍中生长与降解碧两条曲线相重援叠的部分还可青以看出，菌体柱生长与溴氨酸斥降解是同步的泼，所以，确定成最佳降解与生毕长贷p找H勇值哨为纹6.0-7.仪0牲之间。苏从罢图步4墓可以看出，温辞度对氏S稳.滩xenop创haga环QYY爹生长的影响较蛮为显著，产在标30挖℃骗时，菌体生长疗出现最大值，忌而温度高于或犹是低冶于鬼3座0助℃须，都不利于菌筐体生长，接泉近纪4泰0育℃茎时，菌体几乎复不生长。因此换，可以确定菌斗株生长的最适邻温度拍为伶3瓦0尼℃刺。押与控p致H泳对溴氨酸降解详的影响不同，暑溴氨酸降解对晕温度并不敏感俊，从煌图柿4巡可以看出，昂在倍20-3专5登℃御之间，溴氨酸眉都能够维持着感较高的降解率条。只有慰在声4乖0乘℃修时，溴氨酸的晋降解几乎完全庸受到抑制。考详虑到溴氨酸降姑解适应的温度掀范围比较广，肾而菌体生长的辟温度要求比较订严格，所以确脊定最佳降解与蝇生长温度社为权3者0汤℃礼。意3.4锅不同供氧量与云不同接种量对场溴氨酸降解及甚菌株生长的影晴响眉+想由于趣S俘.珠xenop厘haga购QYY雅为好氧菌，所认以以摇床的不厅同转速来表征属供氧量，考察士各个转速对菌姿体生长和溴氨短酸降解的影响郊。不同转速下达，菌体都有不构同程度的生长见。在静止条件齐下，也有部分绿生长，说明该险菌并非严格好仅氧菌。如我图冲5鲁所示，卸在橡150r/泄mi疲n佛时菌体浊度最题大，所以选倘择伟150r/唐mi保n仰为菌体生长最产佳转速。同时蕉，溴氨酸的降芳解率曲线接近丘于平滑曲线，碑这说明无论摇答床转速怎样改并变，只要菌体湖有生长，就能升满足溴氨酸降乏解的需要。将沫菌体生长一并丛考虑，确定最揉佳摇床转速庆为沉150r/雄mi亏n萍。许如撇图兰6你所示，菌体的至生长随着接种挨量的增加而增榆加，而溴氨酸扭的降解似乎与榜接种量无关，光总能维持在恒物定的降解率。恼结合考虑二者云，选溉取乳10洲%我为最佳接种量纱。魄3.5斯S舌.动xenop萌haga塔QYY爪生长与降解特秤性抱3.锹5卸.1片富集培养基中编菌株生长与溴进氨酸降解发图跪7膝中所示为富集沾培养基中关S逢.滔xenop翻haga润QYY坡的生长与溴氨萝酸的降解情况堡。从图中可以璃看出，其生长特曲线符合典型斧的微生物生长匠模型，即分为倡延滞期、对数句生长期、稳定滨期及衰亡期。愈该菌株接种后侦，在新鲜培养院基中要经过住12炼个小时的延滞榜期来适应新的革生长环境。然激后，进入对数敬生长期，这段峰时间大约为扇12友个小时。经过紧24奉个小时的生长妈，菌株进入稳晶定时期，维持花5-6译个小时，从而庸，因营养物质饲被消耗，菌体杠开始死亡。轿随着菌株的生鸣长，溴氨酸被南降解。从图中夏可以看出两条受曲线存在交叉封点，很显然，胀在这一点之前艳，虽然菌体生勉长缓慢，但是彻，溴氨酸的降非解已经发生；置而在这点之后租，溴氨酸迅速个被降解，降解常率缠达顺98穷%污以上，以致在粥相当一段时间仰内维持这个恒孕定的降解率。诊可以得出结论若：溴氨酸的降春解发生在菌株费生长的早期而熔不是对数期，葱说明了菌体少拍量的生长足以穷使溴氨酸降解虾，这晴与的3.将3木和竟3.挖4君部分的结论相骤吻合。养图细7牌富集培养基中万菌株生长与溴俯氨酸降解改3.面5挡.2偷唯一碳氮源培退养基中溴氨酸秆的降解掏如狭图昌8绵的实验结果表抢明，当浓度小欣于仓500mg怪/l众时，宋S先.恰xenop嘴haga禁QYY季在以溴氨酸为富唯一碳、氮源穿培养基中可使帝溴氨酸的降解漆率达跪90%强以上，当溴氨会酸浓度大于保500mg备/l蛋时，在初始的棵降解阶段，其找降解速率明显拾要大于低浓度保的降解速率，塞但浓度大于己800mg/少l恼时，溴氨酸的喘降解受到抑制爽，因此，实验膊浓度可在低于巨800mg/幅l宏进行。如图所像示：3结论传（积1剪）从山东招远抢化工厂的溴氨例酸生产车间的胞污泥中筛选出做一株溴氨酸降恭解菌，该菌株幸可以溴氨酸为榴唯一碳、氮源暂生长。骡（造2稿）订经生理生化、咬形态学及赢16SrR内NA瓣鉴定该菌株为班Sphing滋omonas庙xenop史haga廊，彩对其进行命名锡为三Sphing阔omonas惰xenop绑haga军QYY但，插归属变形细菌飘α陕亚类候，饭鞘氨醇单胞菌坑属菌种。赏（杏3吉）确定该菌株倚的最适降解与色生长条件分别受为：膨PH6.承0-7.0戴，鼓T30拼℃榴，转速篇150r登min醋-1向，盾接种量某10%限，在唯一碳氮躬源培养基中可喷耐受的溴氨酸粮浓度为古1000m嚼gl僚-1村。溴氨酸的降旅解发生在该菌籍生长的早期，英而不是发生在装对数生长期。参考文献：仗[1]自Julian介aA.R丛amasy,高Chris见Goode睛.Deco适lorati纠onof注acarp搅etdye沈efflu寒entus浪ing辞Trame龙tesve致rsicol那or.给Biote蓬chnolo驼gyLet痛ters,事2004,牵26:19艳7-201.竖[2]休Kuo-C异hengC吩hen,J扬ane-Yi巴iWu,赠Dar-Je纤nLiou夺,Sz-C早hwumJ阴ohmHw耕ang.D裕ecolor钓izatio涂noft狐hetex努tiled古yesby臭newly另isola乓tedba杠cteria闪strai慌ns.Jo跟urnal纳