级药学专业毕业答辩

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引言

中南大学湘雅二医院药学部研究生课题1.课题来源第3页/共24页

引言目的：通过LC-MS/MS方法，定量测定儿童血清中25-(OH)D3和24R,25(OH)2D3的含量意义:

本次研究希望通过建立方法学，利用LC-MS/MS准确检测体内维生素D3代谢物水平

2.研究目的与意义第4页/共24页维生素D是一种阳光维生素，其中维生素D3是存在的主要形式之一，目前被广泛认可的作用，除了可以促进儿童和成年人的骨骼健康，还对其他健康有益，包括降低如自身免疫病、常见的癌症以及心血管疾病等慢性疾病的患病风险。VD的来源是通过皮肤接受阳光照射产生或饮食中摄入获得

☞引言第5页/共24页然而，维生素D3及其代谢物在体内的含量极低，很难测得到。目前测定VD3及其代谢物浓度没有统一的标准，主要有放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、液相色谱法(HPLC)、电化学发光法以及近几年发展起来的液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)酶免疫分析法曾经是检测血清中VD3及其代谢物浓度的最主要方法，且至今仍在被广泛应用，但酶免疫分析法的主要缺陷是抗体之间的交叉反应导致的方法特异性不足

☞引言?第6页/共24页色谱分析法可对这些分析物进行有效分离，从而获得足够的特异性。在这一方面，液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法有很大的优势。由于LC-MS/MS法的高选择性、特异性和灵敏度，目前该分析技术已被众多临床研究机构研究公认为人体内源性物质测定的金标准

☞引言EylesD,AndersonC,KoP,etal.AsensitiveLC/MS/MSassayof25(OH)vitaminD3and25(OH)vitaminD2indriedbloodspots[J].ClinChimActa,2009,403(1-2):145-15第7页/共24页实验内容

一样本制备标准曲线溶液的制备标准曲线储备液制备25(OH)D3

和24R,25(OH)2D3标准品分别用乙腈定容，配制成浓度分别为1mg/mL、0.2mg/ml的储备液内标储备液的制备内标d6-25(OH)D3(50μg/mL)用乙醇定容配制成浓度为10μg/mL的储备液,用乙腈稀释至100ng/mL即可内标工作液制备取内标储备液用乙腈稀释至100ng/mL衍生化试剂PTAD溶于乙腈配制成1mg/mL的溶液。将制备好的以上溶液与衍生化试剂储存于-80℃待对照品的制备呢？第8页/共24页

二样本衍生化XXXXXXXXXXXXXXXX怎么克服？XXXXXXXXX先前有研究报道，我们本次研究的样本制备与衍生化的方法，样品前处理简单，只需要少量的样品（200μL）和两步蛋白的沉淀与提取，采用的提取试剂是乙腈，没有复杂和耗时的过程，如固相萃取（SPE）或液-液萃取（LLE）；并且在蛋白质衍生化过程，样本不需要在特定条件下进行，如此，便于在大批量样本中进行快速测定。由于VD代谢物25(OH)D3和24R,25(OH)2D3离子化效率很低，在质谱检测器中干扰较大，很难有最佳响应和图谱峰形，不利于特异性检测和痕量物质的测定AronovPA,HallLM,DettmerK,etal.MetabolicprofilingofmajorvitaminDmetabolitesusingDiels-Alderderivatizationandultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].AnalBioanalChem,2008,391(5):1917-1930第9页/共24页

色谱与质谱条件的优化三通过加入的标准衍生试剂，优化质谱参数来探讨衍生化的标准。为了获得满意的分离的色谱柱和不同梯度的流动相。优化LC-MS/MS条件被列在“实验方法”部分。PTAD衍生的维生素D代谢物包括6S和6R两个差向异构体。因为共轭双烯基团将S型双烯化合物作为目标化合物从正面和侧面进攻，如图所示，该结果是25(OH)D3-PTAD和24R,25(OH)2D3-PTAD的洗脱峰，而主峰是通过产生的6S的异构体进行定量。第10页/共24页

色谱与质谱条件的优化三在正离子模式多反应监测条件下，在25(OH)D3

和24R,25(OH)2D3质谱图(如图所示)的主峰分别为m/z558，m/z574，来自于质子化合物C25位失去一个水分子（[M+H-H2O]+）。将生物样本中的待测物与4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮（PTAD）进行衍生化反应，引入极性基团，增大待测物分子量，增加了待测物的离子化效率和测定灵敏度。第11页/共24页待测物衍生生化反应过程图第12页/共24页

25(OH)D3-PTAD质谱图第13页/共24页24,25(OH)2D3-PTAD质谱图因此，[M+H-H2O]+的离子的结合需要前体体离子。此外，我们还观察到在PTAD衍生化的分析物改性物产生质荷比（m/z）为298的主要碎片离子，它是从C6和C7之间的键断裂而获得裂解离子第14页/共24页四、标准曲线、检测限与定量下限取25(OH)D3和24R,25(OH)2D3标准溶液用乙腈逐级稀释成如下：25(OH)D3(0.10,0.21,1.04,5.21,52.08,197.92,833.33和1000.0ng/mL)，24R,25(OH)2D3(0.25,0.50,2.08,7.92,50.0,100.0,200.0和333.33ng/mL)，按“2.2.1项”处理方法处理后测定，以待测物浓度x为横坐标，待测物和内标峰面积比值y为纵坐标，最小二乘法线性回归，加权系数为1/x2.。标准曲线用方程表示，标准曲线线性用相关系数(r2)表示Analyte标曲线性方程(Regressionequation)相关系数（r2）线性范围（ng/mL）定量下限（ng/mL)25(OH)D3y=0.5244x-0.44060.99990.10-1000.00.1024,25(OH)2D3y=0.7135x-1.86780.99360.25-333.330.25表3.1各待测物线性回归方程及相关系数、线性范围、定量下限第15页/共24页

标准曲线图A25(OH)D标准曲线图

B24,25(OH)2D标准曲线图各待测物在所建测定范围内线性关系良好，回归系数均在0.99以上，25(OH)D3和24,25(OH)2D3的最低定量限(LLOQ)分别为0.10ng/mL、0.25ng/mL第16页/共24页

五、精密度、准确度：加样回收试验由于待测维生素D代谢物含量极低并且血清中存在内源性物质，因此很难获得的，所以方法的准确度和精密度是由已知分析物与不同浓度的标准混合人血和制备好的待测未知样本测得的。日间、日内精密度RSD（%）的范围分别为4.8%～13.4%和5.2%1～2.9%，而准确度又叫加样回收试验，其结果如表3.2所示，Analyte加入标准品浓度AddedConcentration(ng/mL)Intra-day(日间)Inter-day(日内)RSD(%)Accuracy(%)RSD(%)Accuracy(%)25(OH)D31007.0100.86.199.41505.4100.35.2102.12005.499.75.4101.524,25(OH)2D31013.4100.312.999.2154.895.76.1103.12012.5101.412.2100.3表3.2精密度与准确度表明了该方法的准确性与重复性良好第17页/共24页

五、稳定性稳定性试验结果表明，在避光条件下，五次冻融循环后，衍生化的维生素D代谢产物是稳定存在的，同样在4℃自动进样器也可以稳定96小时[2，7]。在这种方法中，在避光条件下至少三次冻融循环后，我们观察到的衍生分析物是稳定，可稳定存放在自动进样器在4℃至少72小时？为什么没做专属性实验呢第18页/共24页国外文献考证TatsuyaHIGASHI.SimultaneousDeterminationof25-HydroxyvitaminD2and25-HydroxyvitaminD3inHumanPlasmabyLiquidChromatographyTandemMassSpectrometryEmployingDerivatizationwithaCookson-TypeReagentBiol.Pharm.Bull.24(7)738—743(2001)HedwigC.M.Stepman.CandidateReferenceMeasurementProceduresforSerum25-HydroxyvitaminD3and25-HydroxyvitaminD2byUsingIsotope-DilutionLiquidChromatography–TandemMassSpectrometry.ClinicalChemistry57:3441–448(2011)PavelA..MetabolicprofilingofmajorvitaminDmetabolitesusingDiels–Alderderivatizationandultra-performanceliquidchromatography–tandemmassspectrometry.AnalBioanalChem(2008)391:1917–1930第19页/共24页结果与讨论

本次研究采用LC-MS/MS测得25(OH)D3和24R,25(OH)2D3的浓度分别在0.10～10000ng/mL、0.25～333.33ng/mL范围内，峰面积与浓度线性关系良好，回归系数均在0．99(n=5)以上。25(OH)D3和24R,25(OH)2D3的最低定量限(LLOQ)分别为0.10ng/mL、0.25ng/mL；日间、日内精密度RSD（%）的范围分别为4.8%～13.4%和5.2%1～2.9%；而准确度又叫加样回收试验，加样回收率的范围分别为99.4%～102.1%和95.7%～103.1%（n=5）第20页/共24页结果与讨论

以上实验结果的数据显示，LC-MS/MS能准确地测定体内VD代谢物的含量，可分别测定25(OH)D3和24R,25(OH)2D3。我国人群中的维生素D缺乏率可能有所低估，