第2讲植物的人工繁殖

上节课回顾两个思考题1.什么是细胞工程？2.细胞工程包含哪几个主要研究内容现在是1页\一共有88页\编辑于星期一例子1：兰花组织培养名贵兰花——达摩兰：以禅宗“一花开五叶，结果自然成”的诗意命名。在台湾，早期达摩兰量少，求种者多，非常昂贵；有人曾以一盆爪艺达摩交换台中市一栋高楼。兰花是第一个组织培养成功产业化的植物。珍稀而名贵的达摩兰等名贵兰花，如今已成市井之花。一株不过百元。现在是2页\一共有88页\编辑于星期一例子2：土豆："第二面包"，"植物之王”，热量低于谷类粮食，是理想的减肥食物，和玉米、小麦、水稻、燕麦被称为世界五大粮食作物。欣赏一个视频：脱毒植物的培育/u52/v_Mjk5Mzg5NjE.html问题：1.传统途径存在的问题？为什么要采用组织培养？2.什么是组织培养？原理是什么？3.优点与应用有哪些？现在是3页\一共有88页\编辑于星期一本节主要内容1。组织培养再生植物2。人工种子本节重要问题1。细胞全能性、细胞分化与脱分化2。激素在细胞分化中的调节作用3。植物经组织培养的再生途径现在是4页\一共有88页\编辑于星期一一理论知识回顾——生殖、细胞全能性、细胞分化、脱分化现在是5页\一共有88页\编辑于星期一1.有性生殖（Sexualreproduction）：是两个配子融合为一，成为合子或受精卵，再发育成为新一代个体的生殖方式。2.无性生殖（Asexualreproduction）：不涉及性别、没有配子参与、没有受精过程的生殖都属于无性生殖（Asexualreproduction）。许多高等植物的营养器官（例如根、茎、叶等），在脱离母体后能发育成完整的植株，这种繁殖方式也称为营养生殖。现在是6页\一共有88页\编辑于星期一•3.细胞全能性(totipotency)：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。•细胞全能性学说：1902年，德国植物学家哈伯兰德(Haberlandt)提出了细胞全能性学说，预言植物细胞具有全能性。•植物细胞全能性：细胞全能性首先在植物中被证实，1958年，史都华德（Steward）等利用胡萝卜根韧皮部组织培养出了完整的新植株，证明高度分化的植物营养组织仍保持着发育成完整植株的能力，能以无性繁殖方式繁殖后代。•动物细胞全能性：动物细胞核移植实验证明，胚胎细胞及高度分化的体细胞具有全能性。1997年克隆羊多莉的诞生为揭示动物细胞全能性做出了重大贡献。现在是7页\一共有88页\编辑于星期一•4.细胞分化（Differentiation）：是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。•时间上的分化：是指一个细胞在不同的发育阶段可以形成不同的形态和功能；•空间上的分化：是指同一种细胞由于所处的环境或部位不同可以形成不同的形态和功能。细胞分化能力的强弱称为发育潜能。•形态发生（Morphogenesis）：是指通过细胞增殖、分化和行为塑造组织、器官和个体形态的过程。细胞分化与形态发生是相互联系在一起的。•细胞分化的实质：是基因的差异表达（Differentialexpression），是奢侈基因按照一定顺序表达的结果。现在是8页\一共有88页\编辑于星期一•奢侈基因（Luxurygene）：又称组织特异性基因（Tissue-specificgene），是在各种组织中进行不同的选择性表达的基因，与各类细胞的特殊性有直接关系。•持家基因（House-keepinggene）：是维持细胞的基本结构和最低限度功能所不可少的基因，例如：编码组蛋白、核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖酵解酶等基因。这类基因在所有类型的细胞中都表达。现在是9页\一共有88页\编辑于星期一•5.脱分化（Dedifferentiation）：又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程，即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。•脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之为愈伤组织（Callus）。•需要采用人工诱导技术诱导体细胞的脱分化。不同生物的细胞脱分化能力不同，决定了组织培养再生的难易。现在是10页\一共有88页\编辑于星期一现在是11页\一共有88页\编辑于星期一植物人工繁殖技术目地：为克服自然有性生殖的不足，满足对优良植物的大量需求手段：通过无性繁殖技术实现植物快速繁殖。现在是12页\一共有88页\编辑于星期一植物人工繁殖的方法：组织培养、人工种子、胚胎培养等现在是13页\一共有88页\编辑于星期一一、植物组织培养再生植物植物组织培养（Planttissueculture）是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。现在是14页\一共有88页\编辑于星期一思考题：为什么植物组织培养能实现植物大规模繁殖？与传统繁殖途径的优点在哪里？现在是15页\一共有88页\编辑于星期一（一）植物组织培养的优点•1.周期短，便于人工控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高。•2.占用空间小，不受地区、季节限制。•3.繁殖珍稀、濒危苗木和突变体，是优良品种培育的有效途径。•4.利于保持原来品种的特性。现在是16页\一共有88页\编辑于星期一（二）植物组织培养的应用1.无性系快速繁殖：例如一株兰花一年可以繁殖到400万株。2.种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。3.新品种选育

（1）

利用培养变异，筛选优良突变体。

植物离体培养，能够明显提高突变率，并且会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、植株形态、生育期、耐性等等。可以从中选择优良突变体，培育新品种。

（2）利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性。

有些植物远缘杂交，能正常受精，但受精胚往往败育。此种情况下，可以将幼胚在败育前进行离体培养，以获得缘远杂种植株。

（3）利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。

野生种往往有许多优良性状，如抗干旱、抗病虫害、耐涝、耐瘠薄、耐盐碱、抗冻等特性。但大部分野生种与栽培种杂交不亲和，严重影响了野生种优良遗传基因的应用。利用细胞融合，可以克服这种杂交不亲和性，获得体细胞杂种，使野生种的利用成为可能。

（4）倍性育种现在是17页\一共有88页\编辑于星期一4.离体种质保存

随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用组织培养法，低温保存（-196℃）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。

5.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用。如光合作用、植物营养问题、植物抗病性等等。现在是18页\一共有88页\编辑于星期一（三）植物组织培养技术1.生物条件外植体（Explant）主要指用于离体培养的植物或组织切段。因素：不同植物品种同一品种不同取材部位、发育阶段。一般：生长点、幼嫩组织现在是19页\一共有88页\编辑于星期一2.物理条件：培养环境、组织培养室无菌环境，人工控制温度、光照、湿度等培养条件。需要一定的设备、器材和用具。现在是20页\一共有88页\编辑于星期一•3.化学条件：培养基•（1）无机盐•培养基中无机盐的浓度通常在25mmol/L左右。•根据添加量多少分为大量元素（浓度大于0.5mmol/L）和微量元素(浓度低于0.5mmol/L)。•大量元素：主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁。氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分。•微量元素：主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等。这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并参与生物过程的调节现在是21页\一共有88页\编辑于星期一（2）有机物常用的有机物：糖类、氨基酸、维生素、醇类等。•糖类：是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为碳源，又可以维持渗透压。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%—3%。•氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。现在是22页\一共有88页\编辑于星期一•维生素：以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上不足，通常需加入一至数种维生素。常用的维生素包括：盐酸硫胺素（Thiamine,VB1）、盐酸吡哆醇Pyridoxin,VB6）、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长。Vc有防止组织变褐的作用。•肌醇：对糖类的相互转化有促进作用。能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。•腺嘌呤：是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成。现在是23页\一共有88页\编辑于星期一植物激素(Phytohormone)：是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。能影响生长和分化。•在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制。•植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。现在是24页\一共有88页\编辑于星期一生长素(auxin)生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。•在植物组织培养中，生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化。•常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IAA活力较弱。NAA起动能力要比IAA高出3-4倍。IBA是促进发根能力较强的生长调节物质。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。2，4-D起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成。现在是25页\一共有88页\编辑于星期一细胞分裂素（Cytokinin）•细胞分裂素大多是嘌呤族衍生物，自然状态下分裂素主要在根中形成，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成分裂素。•分裂素的生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大。多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。•主要有激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-苄基腺嘌呤。现在是26页\一共有88页\编辑于星期一激素配比现在是27页\一共有88页\编辑于星期一（4）培养基及分类现在是28页\一共有88页\编辑于星期一几种常用的培养基组分MSB5SHN6大量元素mg/Lmmol/Lmg/Lmmol/Lmg/Lmmol/Lmg/Lmmol/LNH4NO3KNO3CaCl2·2H2OMgSO4·7H2OKH2PO4NaH2PO4·H2O(NH4)2SO4KCl1650190044037017020．618．83．01.51.25250015025015013425001.12.025002004001257502546919.02830166185400463281752.946.6微量元素mg/Lμmol/Lmg/Lμmol/Lmg/Lμmol/Lmg/Lμmol/LKIH2BO3MnSO4·H2OZnSO4·7H2ONaMoO4·7H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2OFeSO4·7H2ONa2-EDTA0.836．215.68．60.250.0250.02527.837．35.010092.5301.001100100753.0102.0250.0250.02527.837.34.550607.0010.110010005.0101.00.250.0215206.080603.51.00.855550.81.63.31.527.837.34.82619.55.2100100蔗糖（g/L）30203050pH值5．75.55.85.8现在是29页\一共有88页\编辑于星期一培养基的配制培养基母液的配制

①大量元素母液：即是含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量较高，一般配制成10倍浓度的母液。在使用时，每配制成1000mL培养液，吸取100mL母液。在配制母液时，要先将各个组分单独溶解，然后按照一定的顺序一边搅拌，一边混合，特别要注意将钙离子（Ca++）与硫酸根、磷酸根离子错开，以免生成硫酸钙或磷酸钙沉淀。②微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量低，一般配制成100倍浓度的母液。在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10mL母液。现在是30页\一共有88页\编辑于星期一③铁盐母液：由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时，容易生成沉淀，所以铁盐必须单独配制成铁盐母液。铁盐一般采用螯合铁（Fe-EDTA）。通常配制成100倍（或者200倍）浓度的铁盐母液，在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10mL（或者5mL）铁盐母液。④维生素母液：是各种维生素和某些氨基酸的混合液。一般配制成100倍浓度的母液。在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10mL母液。现在是31页\一共有88页\编辑于星期一⑤植物激素母液：各种植物激素单独配制成母液。一般浓度为100mg/L。使用时根据需要取用。由于大多数植物激素难溶于水，需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中，再加水定容到一定的浓度。它们的配制方法如下：2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)母液：称取2,4-D10mg，加入2mL95%乙醇，稍加热使之完全溶解，（或者用2mL1mol/L的NaOH溶解后）加蒸馏水定容至100mL。IAA（吲哚乙酸）母液：称取IAA10mg，溶于2mL95%乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL。IBA（吲哚丁酸），GA（赤霉酸）母液的配制方法与此相同。NAA（萘乙酸）母液：称取NAA10mg，用2mL热水溶解后，定容至100mL。KT（激动素）母液：称取KT10mg，溶于2mL1mol/L的HCl中，用蒸馏水定容至100mL。BA（苄基腺嘌呤）母液的配制方法与此相同。玉米素母液：称取玉米素10mg，溶于2mL95%的乙醇中，再加热水定容至100mL。现在是32页\一共有88页\编辑于星期一

4、植物组织培养的基本步骤（1）培养材料的采集植物具有全能性的细胞：受精卵；发育中的分生组织细胞；雌雄配子及单倍体细胞。用哪一部分器官最适于作为组培的材料来源:器官的生理状态和年龄；取材季节、离体材料的大小、取得离体材料的植株质量等。快速繁殖：常用茎尖（长度0.5cm）；脱毒苗：茎尖分生组织（长度小于0.1mm）；现在是33页\一共有88页\编辑于星期一（2）培养材料的消毒①先将材料用自来水洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。②在无菌环境中将材料放入70%的酒精中浸泡30-60s。③再将材料移入漂白粉饱和液或0.1%升汞中消毒。④无菌水冲洗3~4次。现在是34页\一共有88页\编辑于星期一常用的消毒剂：下表列出了目前常用的灭菌消毒剂。其使用浓度和处理时间，应根据外植体的情况及其对灭菌剂的敏感性而定。消毒剂使用浓度（%）去除消毒剂难易消毒时间（min）灭菌效果次氯酸钠次氯酸钙漂白粉升汞酒精过氧化氢溴水硝酸银抗生素25~10饱和溶液0.1~170~7510~121~214~50mg/L易易易较难易最易易较难中5~305~305~302~100.2~25~152~105~3030~60很好很好很好最好好好很好好较好现在是35页\一共有88页\编辑于星期一（3）制备外植体

接种时外植体的大小和形状取决于实验目的（茎、叶、根、花、果实、种子或其中某种组织切块0.5cm，茎尖、胚、胚乳按组织单位切离）（4）接种和培养接种封口温度和光照增殖：新梢形成后，继代，把新梢分株或切段转入增殖培养基中进行增殖。现在是36页\一共有88页\编辑于星期一（5）根的诱导

生根是获得完整植株的一个关键。通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。

促使试管苗生根的方法通常有两种：

1、在固体培养基上诱导生根:当试管苗长到2～3厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定）。

2、浸泡的方法:将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。

现在是37页\一共有88页\编辑于星期一

（6）炼苗和移栽

试管苗的生长环境

无菌异养弱光恒温

现在是38页\一共有88页\编辑于星期一现在是39页\一共有88页\编辑于星期一芦荟的植物组织培养过程

12345

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现在是40页\一共有88页\编辑于星期一5、植物组织培养再生植株的途径现在是41页\一共有88页\编辑于星期一以胡萝卜为例现在是42页\一共有88页\编辑于星期一器官发生途径现在是43页\一共有88页\编辑于星期一现在是44页\一共有88页\编辑于星期一体细胞胚发生途径体细胞胚（Somaticembryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。体细胞胚发生途径：是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。体细胞胚起源于非合子细胞，因此不同于合子胚。现在是45页\一共有88页\编辑于星期一（1）器官外植体直接发生途径现在是46页\一共有88页\编辑于星期一体细胞胚胎发生途径1：叶片

诱导阶段胚胎发育阶段(兰草,Chen等,1999)兰草现在是47页\一共有88页\编辑于星期一现在是48页\一共有88页\编辑于星期一体细胞胚胎发生途径2：愈伤组织诱导愈伤组织形成愈伤组织胚性化球形胚形成子叶胚期蝴蝶兰,Lin等,2000现在是49页\一共有88页\编辑于星期一体细胞胚胎发生途径3：悬浮细胞愈伤组织胚性愈伤组织悬浮培养的胚性细胞团球形胚形成成熟子叶胚现在是50页\一共有88页\编辑于星期一5.植物组织培养的问题分析现在是51页\一共有88页\编辑于星期一现在是52页\一共有88页\编辑于星期一现在是53页\一共有88页\编辑于星期一参考：现在是54页\一共有88页\编辑于星期一（4）品种限制现在是55页\一共有88页\编辑于星期一植物组织培养参考图片/nxy/zwzzpy/ziyuan.html现在是56页\一共有88页\编辑于星期一6.植物组织培养应用举例种子萌发产生的原球茎胚培养产生的原球茎现在是57页\一共有88页\编辑于星期一例子：寒兰组织培养现在是58页\一共有88页\编辑于星期一培养技术现在是59页\一共有88页\编辑于星期一NAA（萘乙酸）：生长素6-BA（6-苄基腺嘌呤）：分裂素S-3307(优康唑)：生长调节剂（促进分蘖、抑制细胞伸长，矮化植物）surose（蔗糖）现在是60页\一共有88页\编辑于星期一现在是61页\一共有88页\编辑于星期一现在是62页\一共有88页\编辑于星期一现在是63页\一共有88页\编辑于星期一现在是64页\一共有88页\编辑于星期一体细胞胚再生途径的应用：现在是65页\一共有88页\编辑于星期一引言/v_show/id_XODYyMTM0OTI=.html现在是66页\一共有88页\编辑于星期一1.定义现在是67页\一共有88页\编辑于星期一

现在是68页\一共有88页\编辑于星期一人工种子的结构

农业生产中使用的天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。目前研制的人工种子的结构:体细胞胚人工种皮人工胚乳

现在是69页\一共有88页\编辑于星期一2.人工种子的优点现在是70页\一共有88页\编辑于星期一3.关键技术问题现在是71页\一共有88页\编辑于星期一（2）人工种皮制作现在是72页\一共有88页\编辑于星期一（3）人工胚乳配制现在是73页\一共有88页\编辑于星期一（4）包埋现在是74页\一共有88页\编辑于星期一海藻酸钠包埋示意图现在是75页\一共有88页\编辑于星期一（5）贮藏与发芽现在是76页\一共有88页\编辑于星期一4.存在的问题现在是77页\一共有88页\编辑于星期一物种主要结果胡萝卜(Daucuscarota)有菌土壤中发芽成苗苜蓿(Medicagosativas)有菌条件下发芽成苗芹菜(