色谱分析法导论

色谱分析法导论第1页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-1-1色谱法混合物最有效的分离、分析方法。将待分析样品的各组分一一进行分离，然后依次检测各组分含量。

14-1色谱法概述茨维特（1872～1919）在1906年创立。俄国植物生理学家和化学家。茨维特应用化学方法研究细胞生理学。1900年他在树叶中发现了两种类型的叶绿素：叶绿素a和叶绿素b，后来又发现了叶绿素c，并分离出纯的叶绿素。

他最重大的贡献是发明分析化学和有机化学中极重要的实验方法——色谱法。他的第一篇关于色谱法的论文发表在1903年华沙的《生物学杂志》上。1906～1910年的论文都发表在德国的《植物学杂志》上。在这几篇论文中，他详细地叙述了利用自己设计的色谱分析仪器，分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。由于他的论文发表在不大知名的期刊上，所以当时没有引起化学界的注意。直到1931年，R.库恩才发现茨维特所发明色谱法的重要性，此法才得到普遍的推广和应用。第2页，共82页，2023年，2月20日，星期六第3页，共82页，2023年，2月20日，星期六

色谱法是一种分离技术；装CaCO3的玻璃柱叫色谱柱；其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱柱中的两相间不断进行着的分配过程。

色谱法的实质是分离，它是根据混合物各组分在互不相溶的两相—固定相与流动相中吸附能力、分配系数或其它亲和作用性能的差异作为分离依据的。当混合物各组分随流动相通过固定相时，在流动相与固定相之间进行反复多次分配，使吸附性能或分配系数有微小差别的物质，在移动速度上产生较大差别，从而得到分离。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。第4页，共82页，2023年，2月20日，星期六A.J.P.MARTIN

和R.L.M.Synge

在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J.P.Martin(马丁)和R.L.M.

Synge(辛格)，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。第5页，共82页，2023年，2月20日，星期六色谱法的发展历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957

基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。第6页，共82页，2023年，2月20日，星期六色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究第7页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-1-2色谱法分类

1.

按流动相和固定相的物理状态分类流动相气体液体超临界流体气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）气固色谱（GSC）气液色谱（GLC）固定相分离依据固体吸附剂吸附液体分配液固色谱（LSC）液液色谱（LLC）固体吸附剂吸附液体分配supercriticalfluidchromatography

第8页，共82页，2023年，2月20日，星期六2.

按固定相的固定方式分类固定相装于柱内的色谱法柱色谱平板色谱固定相呈平板状的色谱法纸色谱薄层色谱第9页，共82页，2023年，2月20日，星期六3.

按分离过程的机制分类吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分的物理吸附性能差异分配色谱：利用不同组分在两相分配系数不同离子交换色谱：利用离子交换原理排阻色谱：利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用第10页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-1-3色谱法的特点和分类

（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高可以检测出10-11~10-13g的物质量。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。第11页，共82页，2023年，2月20日，星期六第12页，共82页，2023年，2月20日，星期六蛋白质中含有碳、氢、氧、氮、硫等元素。其中，氮元素极为特别：氮在绝大多数蛋白质中含量相当接近，一般为15％～17％，平均值为16％左右。因此，丹麦化学家约翰·凯达尔很巧妙地想到，既然氮元素含量稳定，只要准确测量出氮的含量，便能推算出其蛋白质含量。发表于1883年的此方法，无疑为蛋白质的检测做出了巨大贡献。而凯氏定氮法亦有不足之处。最大的问题在于这种方法只能检测氮含量，并不能鉴定蛋白质真伪。不难想象，只要加入含氮量高的物质，就可以骗过凯氏定氮法，轻松获得“高蛋白含量”的称号。以三聚氰胺为例，其分子式由3个碳原子、6个氢原子和6个氮原子组成，氮含量高达66.7％。而牛乳蛋白氮含量只有15.7％，大豆蛋白氮含量也仅有16％。毋庸置疑，在氮含量比较上，三聚氰胺胜出。难怪，有人把三聚氰胺称做“蛋白精”。

第13页，共82页，2023年，2月20日，星期六三聚氰胺具有轻微的生物学毒性。早在1945年，美国纽约里德勒实验室两位毒理学专家便发表论文指出，长期给大鼠、兔和狗喂食大剂量三聚氰胺后，会造成其生殖、泌尿系统的损害，以及膀胱、肾部结石，并可以进一步诱发膀胱癌。国家标准规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为2毫克/千克、0.05毫克/千克和0.01毫克/千克。标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。第14页，共82页，2023年，2月20日，星期六不足之处：

被分离组分的定性较为困难。13-1-3色谱法的特点和分类

（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高可以检测出10-11~10-13g的物质量。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。第15页，共82页，2023年，2月20日，星期六岛津气相色谱仪Clarus500美国PE气相色谱仪

大连气相色谱仪南京HPLC液相色谱第16页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-2色谱分离原理14-2-1色谱分离过程

液液色谱第17页，共82页，2023年，2月20日，星期六对于一个混合样品，要使各组分完全分离，必须满足三点：1.两组份的迁移速率必须有差异；2.区域扩宽速率小于区域分离速率；（区域扩宽：各组分沿柱子的扩散分布）3.在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。第18页，共82页，2023年，2月20日，星期六

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。14-2-2色谱图

试样各组分经色谱柱分离后，从柱后流出进入检测器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电压（或电流）信号，再由记录仪记录下来。所得的电信号强度随时间变化的曲线，称为流出曲线，即色谱图。1.基线2.峰高

色谱峰顶点到基线的距离，h第19页，共82页，2023年，2月20日，星期六

用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）峰底宽(Wb)：色谱峰两边转折点所画切线与基线相交截距；拐点位于0.607h处。（2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度；（3）标准偏差()：拐点间距离的一半，即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。3.区域宽度Wb=4

，W1/2=2.354练习：已知半峰宽为4.708mm，求峰底宽度。第20页，共82页，2023年，2月20日，星期六4.峰面积A峰与基线延长线所包面积，A=1.065hW1/214-2-3保留值1.用时间表示的保留值（2）保留时间（tR）从进样开始到色谱峰出现极大值时所需的时间；组分的保留时间就是它通过色谱柱所需的时间，也就是组分在柱内运行的时间。（1）死时间（tM）不被固定相保留的组分，从进样到出现峰极大值所需要的时间。实际是流动相流经色谱柱所需时间，或组分在流动相中消耗的时间。

对气相色谱，tM指从进样到空气峰（对热导检测器）或甲烷峰（对氢火焰检测器）最高点所经过的时间。第21页，共82页，2023年，2月20日，星期六（3）调整保留时间（t’R）组分的保留时间与死时间的差值。实际是组分被固定相滞留的总时间，反映了组分与固定相之间的作用。（2）保留体积（VR）从进样开始到色谱峰出现极大值时所通过的流动相的体积。（1）死体积（VM）不被固定相保留的组分，从进样到出现峰极大值所消耗的流动相体积。（3）调整保留体积（V’R）保留体积与死体积之差，即组分停留在固定相时所消耗的流动相体积。各种保留时间受流动相流速的影响，各种保留体积与流动相流速无关。2.用体积表示的保留值tR＇=tR－tM

第22页，共82页，2023年，2月20日，星期六

习惯上，t’R2＞t’R1，故α

＞1，标志两峰在色谱图中的相对位置。相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。3.相对保留值（选择性因子，ri,s

或α）

组分2与组分1调整保留值之比：

1.基准组分，可以是被测物中某一指定组分，也可人为配制；2.

组分

色谱分离是基于试样中各组分在两相间平衡分配的差异。平衡分配可用分配系数和容量因子表征。第23页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-2-4分配系数和容量因子

组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：K除了与温度、压力有关外，还和组分的性质、固定相和流动相的性质有关。分配系数是色谱分离的依据。不同组分的分配系数的差异，是实现色谱分离的先决条件，分配系数相差越大，越容易实现分离。1.分配系数（partionfactor）K例：组分A、B在某气液色谱柱上K分别为495，467，哪个先出峰？第24页，共82页，2023年，2月20日，星期六2.容量因子(capacityfactor)

k’

在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：

1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。

2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。

3.分配比可以由实验测得。容量因子也称：容量比（capacityfactor）、分配比（partionradio）msmm第25页，共82页，2023年，2月20日，星期六3.容量因子与分配系数的关系

式中为相比。填充柱相比：5～35；毛细管柱的相比：50～200。容量因子越大，保留时间越长。Vm为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积；msmmmsmm第26页，共82页，2023年，2月20日，星期六4.分配系数K与保留值的关系

当某一组分的色谱峰最高点出现时，说明该组分恰好有一半的量洗脱在VR体积的流动相中流出柱子，其余一半仍留在柱内，即留在柱内的流动相（体积为Vm）与固定相（体积为Vs）中。根据物料平衡原理，得两边同除cmVm≈VM色谱过程的基本方程，将反映色谱行为的保留值与反映物质性质的热力学常数K联系起来。第27页，共82页，2023年，2月20日，星期六5.容量因子与保留值的关系上式也可写为第28页，共82页，2023年，2月20日，星期六注意6.分配系数K及容量因子k’与选择性因子的关系第29页，共82页，2023年，2月20日，星期六

从色谱流出曲线上，得到信息是：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数．（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析．（3）根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据．（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据．第30页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-3色谱法基本理论

色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；第31页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-3-1塔板理论（platetheory）-柱分离效能指标半经验理论；

将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成是由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间被固定相占据，另一部分空间被流动相占据。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。第32页，共82页，2023年，2月20日，星期六塔板理论的假设：

（1）在每一个小段内，平衡可以迅速达到；

（2）将载气看作成脉动（间歇）过程；

（3）试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；

（4）每次分配的分配系数相同。理论塔板高度H

：理论塔板数n：色谱柱长：则三者的关系为：

使组分在柱内两相间达到一次平衡分配所需的柱长；组分流过色谱柱时在两相间进行平衡分配的次数；L；第33页，共82页，2023年，2月20日，星期六塔板理论指出：溶质在柱中的平衡次数，即n＞50时，可得到基本对称的峰形曲线。试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，就可获得良好的分离。由塔板理论推导出的理论塔板数n的计算公式为：扣除死时间，将有效理论塔板数作为柱效能指标：第34页，共82页，2023年，2月20日，星期六注意：

同一色谱柱对不同物质的柱效是不同的。因此说明柱效时除应注明色谱条件外，还应指出是用什么物质测量的。同理，比较不同柱子的柱效时，必须把操作条件固定下来，用同一种物质通过不同的色谱柱，从所得的色谱峰分别计算n有效，该值↑，柱效↑。第35页，共82页，2023年，2月20日，星期六例：已知一根长1m的色谱柱的n有效为1600块，组分A在该柱上的调整保留时间为100s，试求A峰的半峰宽及有效塔板高度。解：第36页，共82页，2023年，2月20日，星期六例：色谱法分离A、B物质的混合物，测得B物质的半峰宽为9mm，调整保留时间为3min20s，记录仪的走纸速度为3000mm/h，该色谱柱的有效理论塔板数是多少？解：第37页，共82页，2023年，2月20日，星期六例：在2m长的色谱柱上，测得某组分保留时间为6.6min，峰底宽0.5min，死时间1.2min，载气体积流速为40mL·min-1，固定相体积为2.1mL，求：（1）分配比k’；

（2）死体积VM；

（3）调整保留体积V’R；

（4）分配系数K；

（5）有效塔板数；

（6）有效塔板高度（流动相体积即为死体积）。第38页，共82页，2023年，2月20日，星期六例：在2m长的色谱柱上，测得某组分保留时间为6.6min，峰底宽0.5min，死时间1.2min，载气体积流速为40mL·min-1，固定相体积为2.1mL，求：（1）分配比k’；（2）死体积VM；（3）调整保留体积V’R；（4）分配系数K；（5）有效塔板数；（6）有效塔板高度（流动相体积即为死体积）。解：分配比k=t’R/tM=(6.6-1.2)/1.2=4.5死体积VM=tMFc=1.2×40=48(mL)调整保留体积V’R=t’RFc=(6.6-1.2)×40=216(mL)分配系数K=k’β=k’(Vm/Vs)=4.5×(48/2.1)=103有效塔板数neff=16×(t’R/Wb)2=16×[(6.6-1.2)/0.5]2=1866有效塔板高度Heff=L/neff=2×1000/1866=1.07(mm)第39页，共82页，2023年，2月20日，星期六

塔板理论的特点和不足

（1）当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。（2）不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。（3）柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

（4）塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第40页，共82页，2023年，2月20日，星期六

减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；

A、B、C三项各与哪些因素有关？14-3-2速率理论（ratetheory）-影响柱效的因素A：涡流扩散项；B：分子扩散系数；C：传质阻力项系数；：流动相平均线速度（cm·s-1）1956年，荷兰学者VanDeemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。1.气相色谱速率理论第41页，共82页，2023年，2月20日，星期六1.涡流扩散项A（多径项）A=2λdp

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子第42页，共82页，2023年，2月20日，星期六

(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。2.分子扩散项B/（纵向扩散项）ν：弯曲因子，反映固定相颗粒的几何形状对分子扩散的阻碍情况，ν<1。Dm：组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）

B=2νDm第43页，共82页，2023年，2月20日，星期六

k’为容量因子；Dm、Ds为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。C=（Cm+Cs）3.传质阻力项C第44页，共82页，2023年，2月20日，星期六将A、B、C三项代入，得范第姆特方程，也叫速率方程，对色谱分离条件的选则具有指导意义。它可说明，填充均匀程度、填充物粒度、流动相种类及流速、固定液膜厚度对柱效的影响。第45页，共82页，2023年，2月20日，星期六2.液相色谱速率理论ⅠⅡⅢⅣⅤ第46页，共82页，2023年，2月20日，星期六Ⅰ：涡流扩散项；Ⅱ：流动区域内，流动相传质阻力；Ⅲ：分子扩散项，液体扩散系数小，可忽略；Ⅳ：流动相停滞区域内的传质阻力；Ⅴ：固定相传质阻力，与气相色谱中液相传质阻力项对应。提高柱效方法：减小填料颗粒粒度dp；用粘度低的溶剂作流动相；低流速的流动相；减小填料孔穴深度；适当提高柱温。第47页，共82页，2023年，2月20日，星期六

速率理论的要点（1）组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。（2）通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。（3）速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。（4）各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。第48页，共82页，2023年，2月20日，星期六思考某人制备了一根填充色谱柱，用组分A和B为测试样测得该柱理论塔板数为4500，因而推断A和B在该柱上一定能得到很好的分离，此推断正确吗？简要说明理由。

答：不正确，决定两组份能否分离的关键是热力学参数选择性因子α，如果α

=1，不管色谱柱柱效如何高，A、B两组份都无法分离。第49页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-4分离度14-4-1分离度

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：①柱效较高,△K

较大,完全分离；②△K

不是很大,柱效较高,峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低,△K

较大,但分离的不好；④△K小,柱效低,分离效果更差。第50页，共82页，2023年，2月20日，星期六分离度也称分辨率或分辨度，相邻两峰分离程度的量度。分离度的表达式：Rs=0.8：两峰的分离程度可达89%；Rs=1：分离程度98%；Rs=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。第51页，共82页，2023年，2月20日，星期六第52页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-4-2色谱分离基本方程设有两个相近的色谱峰A和B，假定两峰峰底宽近似相等。代入分离度定义式：1.柱效n、容量因子k’、选择性因子α和分离度R的关系第53页，共82页，2023年，2月20日，星期六第54页，共82页，2023年，2月20日，星期六对难分离物质对，KA≈KB，k’A

≈

k’B=K’，α趋于1，上式简化为：第55页，共82页，2023年，2月20日，星期六2.保留时间tR与分离度R的关系分离完全所需要的时间第56页，共82页，2023年，2月20日，星期六预测保留时间第57页，共82页，2023年，2月20日，星期六动力学因素项选择性因子项容量因子项第58页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-4-3分离性能的优化1.提高柱效

提高柱效是提高分离度最直接的有效手段，n=L/H，n↑，则L↑，或H↓。降低H最有效。给定色谱柱，可优化操作条件，如改变流动相组成和流速以及色谱柱柱温。给定固定相，增大柱长。柱长不变时，设法降低板高H。2.调节、控制容量因子k’第59页，共82页，2023年，2月20日，星期六GC中，升高柱温，降低k’。LC中，控制流动相强度（极性），调节k’。

α=1不分离，

α↑，Rs↑。α的微小变化对R影响很大。故增大α值是改善分离度的最有利手段。3.提高选择性因子改变流动相组成降低柱温绝大多数α与柱温成反比，降低柱温，α升高改变固定相第60页，共82页，2023年，2月20日，星期六例题：

在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，塔板数为3600块，柱长1m。计算分离度。要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。分离度：解：第61页，共82页，2023年，2月20日，星期六例：两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。试问：1）柱分离度R；2）柱平均理论塔板数nav3）平均塔板高度Hav4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？1）2）第62页，共82页，2023年，2月20日，星期六3）4）第63页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-5色谱法重要关系式小结参数

符号

测定或计算

死时间(迁移时间)，不参与分配组分

Mt

色谱图

保留时间，组分1和2

21RRt，t

色谱图

调整保留时间，组分1

'tR1

MR'R1ttt1-=

峰宽，组分1和2

Wb1，Wb2色谱图

柱长

L

直接测量

流速

Fc

直接测量

流(固)定相体积

Vm，Vs

填充制备记录

流(固)定相浓度

cm，cs

分析和制备记录

第64页，共82页，2023年，2月20日，星期六参数

符号

测定或计算

线速

Mt/Lu=

流动相体积

cMmFtV=

容量因子

MMRt/)tt(k’-=

msVKVk’=

分配系数

smVk’VK=

msccK=

选择因子

MR1MR2tttt--=a

1212KKk’k’==a

分离度

b2b1R1R2WW)tt(2Rs+-=

)k’1k’)(1(4nRs+-=aa

塔板数

2R)Wbt(16n=

222)k’k’1()1(Rs16n+-=aa

板高

nLH=

保留(分析)时间

2322rk)k1()1(uHR16t+-=aa

第65页，共82页，2023年，2月20日，星期六14-6色谱定性和定量分析13-7-1定性分析1.利用纯物质定性的方法通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。第66页，共82页，2023年，2月20日，星期六2.利用相对保留值α定性

α指组分与基准物的t’R的比值，它仅与柱温和固定液性质有关，与其他操作条件无关。因此比保留值定性更方便、可靠。基准物：选取易得到纯品的，而且与被分析组分保留值相近的物质，如：正丁烷、正戊烷、环己烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

若未知样品较复杂，可将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。

注意：当进样量很低时，若峰不重合，峰中出现转折，或半峰宽变宽，则一般可肯定试样中不含有与所加已知纯物质相同的化合物。3.加入已知物增加峰高法第67页，共82页，2023年，2月20日，星期六4.保留指数定性法柯瓦指数（Kovats）指数，用I表示，表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际公认的定性指标，具有重现性好，标准统一及温度系数小等优点。测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有n和n＋1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：t’R(n)t’R(X)t’R(n+1)'''ttt>>)()()(nRXRnR+1第68页，共82页，2023年，2月20日，星期六100（n+1）Ix100nlgt’R(n+1)lgt’R(x)

lgt’R(n))()()()1('lg'lg100'lg'lg100)1(100+--=--+nxRxnRnRRttnIttnn第69页，共82页，2023年，2月20日，星期六

注：同系物组分的ΔI一般为100的整数倍，而除了正构烷烃外，一般其它物质的I不等于该化合物的含碳数乘100。练习：在阿皮松L柱上，柱温100℃时，测得某组分的t’R为310.0mm，正庚烷t’R为174.0mm，正辛烷的t’R为373.4mm，求组分Ix。与文献值对照，相同色谱柱及100℃柱温下，乙酸正丁酯

I=775.6练习：P32122第70页，共82页，2023年，2月20日，星期六5.用经验规律和文献值定性

当没有待测组分纯标准样品时，可用文献值定性，或用气相色谱中的经验规律定性。（1）碳数规律（同系物）大量实验证明，一定温度下，同系物的lgt’R与分子中碳原子数称线性关系，即（2）沸点规律（同族同碳数异构体化合物）第71页，共82页，2023年，2月20日，星期六练习：含n-C10，n-C11，n-C12烷烃混合物，在某色谱条件下流出时n-C10，n-C11的t’R为10和14min，求n-C11的t’R。A1=0.073，C1=0.27第72页，共82页，2023年，2月20日，星期六6.双柱、多柱定性

对复杂样品，组分较多，在一根柱上可能出现两组分有相同的保留值，若使用双柱或多柱，则原来在一根柱上出现相同保留值的组分，在另一柱上就可能出现不同的保留值，从而实现定性。7.与其他方法结合小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD第73页，共82页，2023年，2月20日，星期六13-7-2定量分析定量分析依据：操作条件一定时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比，即定量分析要解决三个问题：准确测量检测器的响应信号—峰面积或峰高；准确求得比例常数—校正因子；正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量。第74页，共82页，2023年，2月20日，星期六（1）峰高（h）乘半峰宽（W1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍：

A=1.065hW1/2（2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0