蛋白质研究技术课件

蛋白质研究技术一、蛋白质的理化性质蛋白质的胶体性质蛋白质的两性电离蛋白质分子颗粒大小1~100nm之间,属胶体颗粒范围蛋白质的胶体原因：

表面形成水化层

表面同种电荷的斥力

蛋白质的胶体性质

在溶液中能形成稳定的胶体

蛋白质胶体性质与蛋白质沉淀1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）；2、酸碱（等电点沉淀）；3、有机溶剂沉淀；4、重金属盐类沉淀；5、生物碱试剂沉淀6、加热变性沉淀(1)盐析法(saltingout)

常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等

使蛋白质沉淀的方法

概念：向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析

特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性

作用原理:

盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力(2)有机溶剂沉淀法

注意事项:

必须在低温下操作尽量缩短处理的时间及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去

缺点：常会使蛋白质变性常会使蛋白质变性原理:

使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀

常用有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮

(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法

缺点：常引起蛋白质变性

原理:

生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀注意事项:

反应溶液的pH<pI，确保蛋白质以阳离子形式存在

等电点沉淀：pH=pI时引起蛋白质的沉淀(二)蛋白质的凝固概念：变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固，凝固作用本质上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果如加热可使蛋白质变为不能再溶解的凝块超滤：利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤透析：将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化（三）透析和超滤超滤工作图(四)电泳

概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方向移动的现象原理：不同的蛋白质的因结构、形状和带电量的不同而有不同的泳动速度，从而达到分析和分离蛋白质的目的应用：电泳技术是生化常用分析技术之一

(四)电泳

分类：自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进

行电泳，不同组分形成带状区域

-纸电泳：用滤纸作为支持物

-凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物

圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳

平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳

(四)电泳

电泳的应用：蛋白质分子量的测定：SDS,Native蛋白质等电点的测定：

IsoelectricFocusing

蛋白质组学研究：双向电泳

样品处理染色电泳蛋白质分子量的测定（SDS

）(四)电泳

(四)电泳

蛋白质等电点的测定(五)层析原理：溶质在互不相溶的两相之间分配行为存在差别，从而导致移动速度的不同

离子交换色谱(ionexchangechromatography)

疏水作用色谱(hydrophobicchromatography)

凝胶过滤色谱(gelfiltrationchromatography)

亲和色谱(affinitychromatography)

金属螯和色谱(metalchelatingchromatography)

离子交换色谱原理：根据离子交换树脂对各种离子的亲和力不同而达到分离的目的，大分子因与树脂亲和力不同，以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或(和)pH使大分子从树脂上先后被洗脱

分为：阴离子交换基：DEAE（二乙胺乙基）

QAE（季铵乙基）

阳离子交换基：

CM（羧甲基）

P（磷酸基）

SP（磺丙基）实验条件的选择2468101214等电点-体系

pH蛋白质带负电荷+蛋白质带正电荷

根据蛋白的性质选择适宜的pH值和缓冲体系0疏水作用色谱原理：根据蛋白质与吸附剂之间的弱疏水性作用的差别进行蛋白质的分步洗脱各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂常用的疏水性配基：苯基、短链烷基C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚疏水吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，过小则疏水性吸附作用不足，过大则洗脱困难

疏水作用色谱的洗脱一般采用降低缓冲液中的盐浓度来洗脱蛋白也可以采用加入少量的有机溶剂来洗脱，如反相色谱疏水作用色谱Fraction凝胶过滤色谱的应用生物大分子的分离纯化分子量的测定分级分离溶液浓缩平衡常数的测定细胞及颗粒的分离亲和色谱原理：利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到固相载体上，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，可以与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则不能结合，然后用适当方法使生物大分子从配体上洗脱下来，从而达到分离提纯的目的

特点：纯化效率高，提纯度可达几千倍配体蛋白质蛋白质和配体复合物交联试剂载体配体载体与配体交联体杂质杂质游离配体洗脱结合耦联作用机理亲和色谱的洗脱亲和色谱的应用

抗原和抗体

激素和受体蛋白

凝集素和多糖(糖蛋白)

酶与辅酶(或产物、抑制剂)

核酸与互补链（或核酸多聚酶、结合蛋白）

细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）金属螯合色谱原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离NH2NH2NiHisHisHisHisprotein特点：体系复杂:含量低、组分多、干扰大水溶液体系：接近生理状态，尽量避免使用有机溶剂低温操作：防止蛋白变性和失活必要的添加剂：蛋白酶抑制剂、还原剂专业的仪器设备：制备型蛋白质分离、纯化和鉴定蛋白质分离、纯化和鉴定蛋白质分离提纯的原则：

纯度、活性和产量蛋白质分离提纯的一般步骤：

破碎细胞→蛋白提取→粗细分级→鉴定分离纯化技术

综合运用各种方法和技术蛋白质分离纯化方法按蛋白质性质分类

溶解度：沉淀(盐析、有机溶剂、等电点)

分子大小、形状：离心、超滤、透析、凝胶过滤层析

分子大小、电荷：电泳、离子交换层析

分子间作用力：亲和层析、金属鳌合层析、疏水作用层析蛋白质分离纯化方法按纯化方法分类

沉淀：盐析、有机溶剂、等电点

电泳：凝胶电泳、等电聚焦

离心：常规、密度梯度

过滤：超滤、透析

层析：离子交换、凝胶过滤、亲和层析、疏水作用蛋白分离纯化的目的

活力的生化分析

蛋白的翻译后修饰（Post-translationalmodifications)相互作用和蛋白的装配(Interactionsandassembly)三维结构(3-dimensionalstructure)生物功能分析(Analysisofbiologicalfunction)药物开发(Drugdevelopment)……

从有机体中获得纯的蛋白要尽可能的用较少的步骤，尽可能少的丢失活力分离纯化策略

细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然的状态)—折叠均一,可溶（主要指非膜蛋白）—可通过差速离心分离细胞组份—纯化可用色谱方法（chromatography）从哪儿开始？

cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但是蛋白易形成包涵体（inclusionbody））

—

重组蛋白基因在大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞中表达

—也用差速离心及色谱方法纯化

—在重组的蛋白中可以添加‘Tags’以便于纯化从哪儿开始？破碎细胞上清

沉淀(丢弃)离心细胞裂解细胞裂解物,蛋白核酸及小分子多步纯化(包括盐析、过滤、层析等)不需要的分子

纯蛋白从组织细胞中进行蛋白分离流程图蛋白质粗分离I：从组织细胞

--提取哪个物种合适？

丰度及活力特点

大小，成本及物种的可获得状况哪个组织合适?

对于特定的细胞哪个组织丰富

组织中哪种细胞中有这类蛋白

纯化过程中的作为应该与特定的方案相关非常有益的信息

大小、组成影响组织提取的因素

缓冲液（Buffer）离子强度（Inoicstrength）金属离子螯合剂（Metalionchelators）还原剂（Reducingagents）蛋白酶抑制剂（Proteaseinhibitors）温度（Temperature）组织的破碎方式（Tissuedisruption）组织破碎

(Tissuedisruption)

除去不要的组织搅碎匀浆（homogenization）研磨(vesselforextraction)细胞破碎

(CellDisruption)

化学破碎:碱、有机溶剂、去污剂酶学手段:溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶

(常适用于含细胞壁的细菌及植物细胞)

物理方法:渗透压震荡、冻溶机械方法:超声、匀浆、湿磨、压力初步纯化

--热变性

不同的蛋白有不同的热稳定性，且有些蛋白可以在热变性以后再复性

钙调蛋白是能通过热变性而获得纯化的一个很好例子天然结构(%)一般蛋白0(℃)100钙调蛋白初步纯化

--沉淀盐析：减少蛋白质表面的水化层硫酸铵、尿素等电点沉淀：降低蛋白质分子的荷电状态改变体系pH值至pI附近有机溶剂沉淀：减少蛋白表面水化层，增加疏水性降低水的介电常数，降低蛋白溶解性甲醇、乙醇、丙酮、聚乙二醇蛋白质粗分离II：表达蛋白

重组基因的表达

可获得大量的蛋白

可进行突变-structure/activitystudies

可引入具有光谱特性的物质

可引入稳定同位素15N、

2H、

13C(forNMR)

蛋白融合体–便于纯化及免疫学研究菌体细胞破碎总蛋白纯蛋白性质分析培养介质细胞碎片非目的蛋白离心、过滤物理、化学、酶学方法多步纯化步骤重组蛋白分离纯化蛋白质的精细纯化基本策略：综合运用各种层析技术，尤其是特异性比较高的方法，如