蓝耳病毒含量测定

蓝耳病毒含量测定第1页/共16页PRRS病毒含量测定

病毒制品检测室猪病组能力比对试验第2页/共16页PRRSV核酸为单股RNA，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。

*病毒粒子呈球形，20面对称，有囊膜，无血凝性第3页/共16页PRRSV病毒特性有脂质囊膜，对乙醚和氯仿等脂溶剂敏感；在低温下能保持稳定的感染性，但不耐热，56℃处理15~20min，37℃处理10~24h，20℃放置6d或4℃保存1m，病毒滴度将下降10倍。56℃处理45min，或37℃处理48h，病毒可彻底灭活。第4页/共16页PRRSV培养和增殖原代猪肺巨噬细胞：病毒增殖较快，CPE1~4天出现，主要表现为细胞圆缩、聚集和快速崩解；传代细胞系：非洲绿猴肾细胞CL2621、MA104和Marc-145CPE发生较缓慢,一般在感染后2～6天。首先感染细胞呈进行性的细胞溶胀并形成小圆形的细胞丛,接种2～4天后大量感染细胞核圆缩,细胞空泡化并脱落,至5～6天CPE波及整个细胞单层,出现密集小裂隙，最后脱落。第5页/共16页病毒在猪肺泡巨噬细胞内复制健康的猪肺泡巨噬细胞

感染了PRRSV的猪肺泡巨噬细胞第6页/共16页在Marc-145细胞上的病变现象

正常Marc-145细胞（ⅹ100）72h左右，细胞开始圆缩，聚集，并呈灶状脱落（ⅹ100）第7页/共16页5d左右，细胞大片裂解脱落（ⅹ100）第8页/共16页病毒含量测定1、检验器具

75cm2、175cm2细胞培养瓶，96孔细胞培养板，1.5ml离心管、Tip头（1ml、200ul），离心管架，冰盒，记号笔等。2、仪器设备

恒温培养箱、生物安全柜、二氧化碳培养箱、高速离心机、电子精密天平、单道微量移液器（100-1000µl）、单道微量移液器（20-200µl)；八道P300微量移液器（100-300µl)、普通光学显微镜。第9页/共16页

病毒含量测定用细胞Marc-145细胞：猴肾细胞，从母细胞（MA104）克隆而来。生长培养基

DMEM（高糖型，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠），8~10%胎牛血清，双抗细胞健康生长注意事项

无支原体等外源因子感染；培养液pH在7.0~7.3，以7.2为佳;

一般按1：3传代，细胞接种密度为1.5~2.0×105/ml，36~48h长成单层;

血清质量可靠、稳定;

细胞及时传代，一般在72±6h;

细胞传代时消化液用胰酶+EDTA，消化过程应尽可能的缩短；第10页/共16页3、试剂3.1细胞培养液：无血清DMEM细胞培养液；含4%胎牛血清的DMEM细胞培养液；含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液；3.2血清：胎牛血清3.3消化液：0.25%胰蛋白酶+EDTA溶液3.4其他：PBS第11页/共16页4、细胞的准备从液氮中取出Marc-145细胞1支，迅速放入37℃水浴解冻，解冻完全后，1000rpm离心5分钟，倾去上清，将离心沉淀后的细胞用10ml含8%胎牛血清的D-MEM营养液悬浮，分装于1个25cm2细胞培养瓶中，置37℃温箱中培养。连续传2~3代，备用。第12页/共16页5、细胞板的准备取长满单层的Marc-145细胞（传代后72h左右），倾弃培养液，用PBS洗细胞两次，加入消化液到培养瓶细胞面对侧，翻转培养瓶平放以确保消化液完全覆盖细胞层。静置15～30s，弃去大部分消化液，只保留少量消化液，置37℃温箱。待消化完全后加入少量含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液，吹打细胞使其分散，按细胞培养时1：3的体积比例制成细胞悬液（细胞浓度约为15万～20万/ml），混匀，用多道移液器加入96孔细胞培养板中，每孔200μl，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。第13页/共16页6、样品的稀释将冻干样品先用5ml无血清D-MEM营养液稀释成4头份/ml，再做4倍稀释（即取1ml加入到3ml无血清D-MEM营养液中，即为1头份/ml）。然后再做10倍系列稀释，即0.1ml样品加入到0.9ml无血清D-MEM营养液中，涡旋混合均匀，如此连续稀释，取10-3

、10-4

、10-5

、10-64个稀释度进行测定。注：样品稀释过程应尽量在低温条件下进行第14页/共16页7、测定将稀释好的样品加到制备好的已长成Marc145细胞单层（36-48h，一般不要超过48h）的96孔细胞板上，每个稀释度6孔（为避免边缘孔效应，细胞板四周细胞孔不做检测用），每孔100μl。同时设立正常细胞对照6孔。加样顺序应按照先加正常细胞对照，再由高稀释度到低稀释度加入细胞板。细胞培养板置37℃、5%