分子标记的种类

分子标记的种类第1页，共44页，2023年，2月20日，星期日第2页，共44页，2023年，2月20日，星期日第3页，共44页，2023年，2月20日，星期日第4页，共44页，2023年，2月20日，星期日第5页，共44页，2023年，2月20日，星期日第6页，共44页，2023年，2月20日，星期日第7页，共44页，2023年，2月20日，星期日第8页，共44页，2023年，2月20日，星期日第9页，共44页，2023年，2月20日，星期日第10页，共44页，2023年，2月20日，星期日第11页，共44页，2023年，2月20日，星期日第12页，共44页，2023年，2月20日，星期日第13页，共44页，2023年，2月20日，星期日第14页，共44页，2023年，2月20日，星期日第15页，共44页，2023年，2月20日，星期日分子标记的种类限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，缩写RFLP)。原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，缩写RAPD)：该技术用一个（有时用两个）随机引物（一般8－10个碱基）非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。SSR(SimpleSequenceRepeatPolymorphisms)：引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，缩写AFLP)。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，缩写SNP）技术。第16页，共44页，2023年，2月20日，星期日第17页，共44页，2023年，2月20日，星期日第18页，共44页，2023年，2月20日，星期日第19页，共44页，2023年，2月20日，星期日第20页，共44页，2023年，2月20日，星期日第21页，共44页，2023年，2月20日，星期日第22页，共44页，2023年，2月20日，星期日第23页，共44页，2023年，2月20日，星期日第24页，共44页，2023年，2月20日，星期日第25页，共44页，2023年，2月20日，星期日第26页，共44页，2023年，2月20日，星期日第27页，共44页，2023年，2月20日，星期日第28页，共44页，2023年，2月20日，星期日第29页，共44页，2023年，2月20日，星期日第30页，共44页，2023年，2月20日，星期日AFLP技术的基本原理AFLP技术是先将基因组DNA用两种限制性内切酶酶切成大小不等的酶切片断,并与含有粘性末端的人工接头相连,形成不同酶切位点的限制性酶切片段,然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增,预扩增产物作为进一步PCR扩增的模板,再选用特异引物进行选择性扩增,扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源的DNA的酶切片段存在差异,因而便产生了扩增产物的多态性。第31页，共44页，2023年，2月20日，星期日第32页，共44页，2023年，2月20日，星期日第33页，共44页，2023年，2月20日，星期日技术流程AFLP技术的具体过程为①DNA提取和质量检测;②双酶切和酶切片段连接;③酶切连接片段的预扩增;④选择性扩增;⑤PCR产物变性后在聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳;⑥将电泳后的凝胶进行银染显影并拍照保存。第34页，共44页，2023年，2月20日，星期日DNA酶切及人工接头的连接(RestrictionoftheDNAandligationofoligonucieotidcadapters)。AFLP技术革新成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,避免其他DNA污染和抑制物质的存在。通过热变性对内切酶进行灭活处理,然后在T4连接酶作用下进行接头连接反应。AFLP接头是一种人工合成的双链DNA,一般长度是14～18个核苷酸,目前试剂盒中的接头是EcoRI接头和MseI接头,其中报道的6碱基内切酶接头还有PstI接头和SacI接头;4碱基内切酶接头还有TaqI接头和SseI接头。第35页，共44页，2023年，2月20日，星期日限制性片段的选择性扩增(Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments)。选择性扩增前,首先用单选择碱基的引物进行预扩增反应,预扩增产物稀释后用于选择性扩增反应。采用这种两步法为以后的分析提供大量的模板,同时对模板起到选择性纯化的作用,从而使产生的指纹图谱更清晰和具有更好的重复性。第36页，共44页，2023年，2月20日，星期日

扩增产物凝胶电泳分析(Gelanalysisoftheamplifiedfragments)。扩增产物通常在4%～6%的变性聚丙烯酞胺凝胶上分离,然后根据引物的标记物质进行相应的产物检测;也可以采用同位素(r233P)ATP,T42DNA连接酶进行末端标记;还可以采用生物素标记。由于AFLP是扩增反应,所以产生的DNA量用银染法(silver2stainingAFLP)也足以得到较高的分辨率。第37页，共44页，2023年，2月20日，星期日第38页，共44页，2023年，2月20日，星期日第39页，共44页，2023年，2月20日，星期日操作程序基因组DNA的酶切人工接头的连接AFLP反应（1）AFLP反应混合物的制备（2）预扩增反应（3）选择性扩增反应聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（1）5％变性胶的制备（2）胶板的准备及灌胶（3）样品的制备（4）上样（5）电泳（6）银染第40页，共44页，2023年，2月20日，星期日AFLP技术的特点AFLP结合了RFLP和RAPD的优点,主要表现在:①AFLP标记理论上可以无限多,可覆盖整个基因组,不需要预知DNA序列信息,呈典型的孟德尔方式遗传;②AFLP技术能高效地检测出DNA的多态性,几乎每对AFLP引物都可以扩增出具有多态性的片段,一般一次检测可获得50-100个AFLP扩增带;③DNA用量少,且对模板浓度变化不敏感;④可靠性好,分辨率和重复性高;⑤引物通用性强。第41页，共44页，2023年，2月20日，星期日AFLP在植物分子生物学研究中的应用

1遗传多样性和亲缘关系研究2遗传连锁图谱构建研究3种质资源鉴定研究4基因定位和克隆研究5基因表达与调控研究6AFLP标记辅助育种研究及其它第42页，共44页，2023年，2月20日，星期日