一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

分子生物学实验室规则自我防护：实验服、一次性手套请勿吃东西正确操作实验器材，保管好自己的实验器材实验废液和废物不可乱扔进垃圾桶污染环境保持实验清洁卫生分组做实验、团队合作交流，勤动手、动脑分子生物学实验成绩评定考勤10%实验操作能力20%实验报告成绩70%实验报告要求目的意义基本原理实验用品实验步骤结果分析讨论（未达预期结果的分析等）实验大纲质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测植物基因组DNA的提取与检测质粒DNA限制性内切酶酶切及连接重组重组DNA的转化及重组子鉴定和PCR技术扩增目的基因实验一质粒DNA的提取及检测实验目的1学习碱裂解法提取质粒的原理和方法。2学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。1.1质粒DNA的提取

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。一、实验原理载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。一、实验原理分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增

收集和裂解细菌

分离和纯化质粒DNA一、实验原理（碱裂解法）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，

10mmol/EDTA-Na，

25mmol/LTris-HCl(pH8.0)

溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，

2%SDS

临用前1：1配制。溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60ml

冰醋酸11.5ml

双蒸水28.5ml作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀二、实验用品1、仪器恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，

10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器。台式高速离心机制冰机微量移液器漩涡混合器二、实验用品2、材料：含质粒pUC18大肠杆菌1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）二、实验用品3、试剂LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5。溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ氨苄青霉素(50mg/mL)抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）

作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。70%乙醇作用：纯化质粒DNA。TE缓冲液或ddH2O作用：溶解DNA三、实验步骤（1）将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），370C培养过夜。取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液。加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min。加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min。三、实验步骤（2）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min。10000rpm×5min，取上清液于另一干净的离心管中。向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm×10min，将上清液转移至新的离心管中。加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm×2min,取上清液于新离心管中。三、实验步骤（3）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h。12000rpm×5min，倒去上清液，吸干液体。加800μL70%乙醇，离心12000rpm×1min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味。加20μLddH2O，混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-200C保存备用。四、注意事项1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL。

2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。

3）在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换，避免污染。1.2DNA琼脂糖凝胶电泳检测

电泳：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。一、实验原理

在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。

当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。1、仪器电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

二、实验用品凝胶电泳系统凝胶成像系统二、实验用品2、材料：提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。3、试剂：

Goldview（DNA染料）

1×TAE缓冲液上样缓冲液（6×）三、实验步骤1、琼脂糖凝胶板的制备

称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μLGoldview混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。三、实验步骤2、加样

胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。3、电泳

将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止