酶工程知识点

酶的分离纯化需要考虑的几点：1、目标酶分子特性及其他物理、化学性质；2、酶分子和杂质的主要性质差异；3、酶的使用目的和要求；4、技术施舍的难易程度5、分离成本的高低；6、是否会造成环境污染。诱导作用：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用。无诱导物时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的结合较强。由于RNA聚合酶的结合位点与阻遏蛋白的结合位点相互重叠，当他们结合时，就把RNA聚合酶结合部位覆盖起来，在空间上排挤RNA聚合酶，使之脱离启动基因部位，使结构基因无法进行转录，酶的生物合成受阻。（不能转录）阻遏现象：酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成收到阻遏。在没有阻遏物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的亲和力弱，不能与操纵基因结合，所以RNA聚合酶可以结合到其在启动基因的位点上，进行转录，而合成结构基因所对应的酶。（能够转录）当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合力增强。阻遏蛋白与操纵基因结合，就排挤RNA聚合酶与启动基因的结合，使转录无法进行，酶的生物合成因此受到阻遏。酶生物合成的模式：同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型同步合成型（生长偶联型）：是酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。特点：在细胞进入生长期时，酶大量合成、不受阻遏作用。延续合成型（部分生长偶联型）：是酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后酶还可以合成一段时间的一种酶生物合成模式。特点：在细胞进入平衡期还可以合成一段时间、受诱导物作用，不受阻遏物作用、mRNA相当稳定。中期合成型（生长偶联型）：在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止。特点：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而酶所对应的mRNA稳定性差。滞后合成型（非生长偶联型）：酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成大量积累。特点：受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用、mRNA稳定性好。酶所对应的mRNA稳定性以及培养基中的阻遏作用是影响酶的生物合成的主要因素。在酶的发酵生产中，最理想的合成模式是延续合成型。其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏，使其是生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止时间。微生物保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法。细胞活化：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复。培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。扩大培养注意事项：1、氮源丰富2、培养到对数生长期，及时培养到发酵罐中3、减少传代次数，降低菌种衰退和污染的可能4、严格控制培养温度、pH、溶氧量。耗氧速率Ko2：指的是单位体积培养液中的细胞在单位时间内所消耗的氧气量。Qo2：是指单位细胞量在单位时间内的耗氧量。细胞呼吸强度Cc:指的是单位体积培养液中细胞的量。Ko2=Qo2·Cc溶氧速率Kd：是指单位体积的发酵液在单位时间内溶解氧的量。调节溶解氧的方法：1、调节通气量2、调节氧的分压3、调节气液接触时间4、调节气液接触面积5、改变培养基的性质提高酶产量的措施：1、添加诱导物2、控制阻遏物的浓度3、添加表面活性剂4、添加产酶促进剂5、基因突变提高酶产量固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采取各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。固定化细胞发酵产酶的特点：1、提高产酶率2、可以反复使用或连续使用较长时间3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失4、发酵稳定性好5、缩短发酵周期，提高设备利用率6、产品容易分离纯化7、适用于胞外酶等胞外产物的生产固定化细胞发酵产酶的工艺条件及控制：1、固定化细胞的培养2、溶解氧的供给3、温度的控制4、培养基的组分控制固定化原生质体的特点：1、变胞内产物为胞外产物2、提高酶产率3、稳定性好4、易于分离纯化固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制：1、渗透压的控制2、防止细胞壁再生3、保证原生质体的浓度端粒酶：是催化端粒合成和延长的酶，是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分。在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分作为模板把端粒重复序列加到染色体DNA的末端，使端粒延长。端粒延伸主要包括三个步骤：1、结合：端粒酶分子的RNA重复序列与DNA端粒末端按照互补配对原则2、延伸：以端粒酶分子的RNA为模板，通过反转录作用，使DNA分子上的端粒延伸3、移位：端粒酶移动到延伸后的独立末端。重复上述过程，反复进行，使端粒不断延伸。基因扩增是通过增加基因数量来调节基因表达的一种方式。它可以发生在个体发育的某一阶段或在细胞分化的某一过程。增强子：又称调变子，是一段能高效增强或促进基因转录的DNA序列。抗体酶：又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体酶的制取方法有诱导法和修饰法。修饰法是对抗体进行分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引进催化基因而成为抗体酶的方法；诱导法是利用特定的抗原诱导抗体酶合成的方法。植物细胞培养产酶的特点：1、提高产率2、缩短周期3、易于管理，减轻劳动强度4、提高产品质量5、具有对剪切力敏感、生长周期长，许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。植物细胞培养产酶的工艺过程：1、外植体的选择和处理2、植物细胞的获取（直接分离法—机械法和酶解法愈伤组织的诱导法原生质再生法）3、细胞悬浮液培养4、分离纯化植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制：培养基的配制控制：1、温度的控制2、pH的控制3、溶解氧的调节控制4、光照的控制5、前提的添加6、刺激剂的应用动物细胞培养具有如下特点：1、动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质和多肽的生产2、动物细胞的生长缓慢3、为了防止微生物污染，在培养过程中需要添加抗生素4、动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感5、大多数细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养6、动物细胞培养基成分复杂，一般要添加血清或其代用品7、原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞动物细胞培养产酶的工艺过程及其控制：1、悬浮培养2、贴壁培养3、固定化细胞培养、分离和纯化4、培养基组成成分5、培养基的配制6、温度的控制7、pH的控制8、渗透压的控制9、溶解氧的控制细胞破碎法：1、机械破碎法2、物理破碎法3、化学破碎法4、酶促破碎法机械破碎法：捣碎发、研磨法、匀浆法原理：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎物理破碎法：温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法原理：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎化学破碎法：添加有机溶剂、添加表面活性剂原理：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎酶促破碎法：自溶法、外加酶制剂法原理：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到细胞破碎。酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称酶的抽取。酶的主要提取方法：盐溶液提取酸溶液提取碱溶液提取有机溶液提取盐溶液提取：用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取：用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶碱溶液提取：用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶液提取：用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基因的酶盐溶：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随浓度的升高而增加，这种现象叫盐溶现象。盐析：当盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低的现象，这称为盐析现象。沉淀分离法：盐析沉淀法：利用不同蛋白质在不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中洗出沉淀，从而使酶与杂质分离。等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，使酶或杂质分离。有机溶剂沉淀法：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。复合沉淀法：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。选择性变形沉淀：选择一定条件使酶液中存在的某些杂质变形而沉淀而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离出来。过滤：借住过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。非膜过滤：采用高分子膜以外的材料，如滤纸、滤布、纤维、多空陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤，包括粗滤和部分微滤。膜分离技术：借住一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。在酶生产中的应用：在酶分离纯化过程中，可以除去酶液中含有的微生物细胞，还能达到酶液浓缩的目的，使用与酶制剂的生产，还可用于酶液的脱盐。层析分离方法：吸附层析法：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物种各组分分离分配层析法：利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析：以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析：利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦：将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离萃取：有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取、反胶束萃取有机溶剂萃取：有机溶剂萃取的两相分别为水相和有机溶剂相，利用溶质在水和溶剂中的溶解度不同而达到分离。双水相萃取：双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离超临界萃取：又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术反胶束萃取：利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。结晶：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法盐析结晶法：在适当的温度和pH等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低，到达稍微过饱和状态，析出酶晶体的过程。有机溶剂结晶法：在接近饱和的酶液中慢慢加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低，析出酶晶体的过程。透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出晶体的过程。等电点结晶法：通过缓慢改变浓酶液的pH使之达到逐渐达到酶的等电点，从而使酶析出结晶的过程。干燥：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某种改变，从而改变酶的催化特性的技术过程。作用：通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些合理的改变，就有可能提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的底物专一性等。同时通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探究其结构和催化特性之间的关系。酶分子修饰：金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链剪切修饰、氨基酸置换修饰、核苷酸置换修饰、物理修饰金属离子置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法。过程：1、酶的分离纯化2、除去原有的金属离子3、加入置换离子作用：1,、阐明金属离子置换修饰的作用2、提高酶的催化效率3、增强酶的稳定性4、改变酶的动力学特性大分子结合修饰：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构像发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。作用：1、通过修饰提高酶的催化效率2、通过修饰可以增强酶的稳定性3、通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性肽链有限水解修饰：在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的催化特性的方法。核苷酸链剪切修饰：在核苷酸的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。氨基酸置换修饰：将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一种氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。作用：1、通过修饰可以提高酶的催化效率2、通过修饰可以增强酶的稳定性3、通过修饰可以使酶的专一性发生改变核苷酸置换修饰：将酶分子核苷酸上的某一个核苷酸置换成另一种核苷酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。物理修饰：通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的催化特