第三章细胞分离技术详解

第三章细胞分离技术详解演示文稿目前一页\总数五十九页\编于六点1优选第三章细胞分离技术目前二页\总数五十九页\编于六点2胞内重组药物

设计试验，请用生物工程学的原理和方法生产治疗糖尿病的胰岛素？目前三页\总数五十九页\编于六点3

分离胞内产物与胞外产物的差别是什么？为回收和提纯胞内产品,必须先将它们从胞内释放到胞外,然后进行分离纯化。可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分泌到胞外;也可用破碎细胞的方法使其释放出来。目前四页\总数五十九页\编于六点4细胞与液体物质的分离又称为固液分离，固液分离方法包括过滤与离心沉降。一、过滤指利用多孔性介质截流固体悬浮液中的固体颗粒，进行固液分离的方法。过滤不但是传统的化工单元，而且是目前工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法。目前五页\总数五十九页\编于六点5过滤一般过滤：微生物、动植物细胞膜过滤：蛋白质等物质的选择性分离一般过滤：以压力差作为推动力。目前六页\总数五十九页\编于六点6二、离心沉降沉降法：指固体颗粒在外力作用下与液体物质做相对运动最终实现固液分离的技术。沉降法根据作用外力的不同，可分为重力沉降和离心沉降。目前七页\总数五十九页\编于六点7离心沉降是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取条件。1）离心沉降的原理：固体和液体之间存在一定的密度差，且固体密度大于液体的密度。2）影响离心沉降速度的因素密度差、颗粒大小、液体粘度、离心力大小目前八页\总数五十九页\编于六点8斯托克斯公式：u=d2(ρs－ρ)rω2/18μ1)密度差越大(ρs－ρ)，离心沉降速度越快；2)固体颗粒尺寸越大，越容易离心;3)液体粘度μ越大，越不容易离心；4)离心力rω2的大小对固液分离影响很大。目前九页\总数五十九页\编于六点93）离心机的分类分离因数Fr＝rω2／g分离因数Fr的大小分为1)Fr＜3000常速离心机2)Fr＝3000～5000中速离心机3)Fr≥5000高速离心机4)Fr=2×104～106超速离心机目前十页\总数五十九页\编于六点10离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为差速离心和密度梯度离心。1)差速离心法如果所要的蛋白质(或生物大分子)主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等；则可利用差速离心（differentialcentrifugation）方法将它们分开收集，该细胞组分作为下步纯化的材料。目前十一页\总数五十九页\编于六点11优点：可以一下子除去很多杂蛋白质，使纯化工作容易得多。如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。目前十二页\总数五十九页\编于六点12差速离心法的原理差速离心是利用不同离心速度产生不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分别分开。不同物质有不同的形状、大小、质量和密度，当在介质中离心时，它们的沉降速度各有差异。目前十三页\总数五十九页\编于六点13大的颗粒碎片在低速时很快沉降，被分离的物质留在上清液中;逐步增加离心力，进一步离心上清液，使中等颗粒沉降，最后是大小和密度最小的颗粒沉降。注意：每次得到的沉淀，必须经过几次洗涤后，反复悬浮和离心，才能得到比较纯的部分。目前十四页\总数五十九页\编于六点14差速离心图示目前十五页\总数五十九页\编于六点15差速离心的方法为了将细胞中各种组分纯化分离，首先要在等渗缓冲液中把细胞破碎匀浆;然后用差速离心的方法，把匀浆液中的各种组分分离;在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心管底部的速率不同。目前十六页\总数五十九页\编于六点16差速离心的方法当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底；加大离心力后，又可分离出线粒体；离心力再加大，才能分离出微粒体和核糖体。最后几步的超离心力，可超过地心引力的10万倍以上，悬液经离心分离出核糖体以后所剩的上清液，则是由细胞原生质的可溶性部分和极微小的颗粒所组成，这些组分则需要更严格的离心方法才能分离出来目前十七页\总数五十九页\编于六点172)一般密度梯度离心法也称分级区带离心，有：1）蔗糖密度梯度离心2）氯化铯密度梯度离心用于RNA-DNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离目前十八页\总数五十九页\编于六点18一般密度梯度离心法：把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续的分离区带。目前十九页\总数五十九页\编于六点19一般密度梯度离心图示目前二十页\总数五十九页\编于六点203)等密度梯度离心法等密度梯度离心法：不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）并形成区带，此即等密度梯度离心法。目前二十一页\总数五十九页\编于六点21等密度梯度离心法目前二十二页\总数五十九页\编于六点22三、离心过滤 1）离心过滤的原理以离心力作为推动力完成过滤操作,具有离心和过滤的双重作用。2）影响离心过滤速度的因素过滤面积和离心力目前二十三页\总数五十九页\编于六点23离心过滤机可分离固体密度大于或小于液体密度的悬浮液。可分为:连续式离心机和间歇式离心机。目前二十四页\总数五十九页\编于六点24第二节细胞破碎细胞破碎：指选用物理，化学，酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。目前二十五页\总数五十九页\编于六点25一、细胞壁结构细胞壁化学组成非常复杂,取决于微生物类型细胞的年龄细胞的生长生理学多糖，脂质，蛋白质在三维结构上的排列方式目前二十六页\总数五十九页\编于六点26细胞壁的结构目前二十七页\总数五十九页\编于六点27二、细胞破碎率破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。1）直接记数法2）间接记数法目前二十八页\总数五十九页\编于六点281）直接记数法平板计数技术需时长；只有活细胞才能计数；会产生误差血球细胞器上用显微镜计数快速而简单，但细胞小计数困难目前二十九页\总数五十九页\编于六点292）间接记数法在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。将破碎后的细胞悬液离心去掉固体（完整细胞和碎片），然后对上清液进行含量或活性分析。酶活性是破碎程度的很好指示参数。目前三十页\总数五十九页\编于六点30三、细胞破碎的方法破碎方法机械法非机械法固体剪切作用液体剪切作用珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法目前三十一页\总数五十九页\编于六点311）珠磨法（图3-6）作用机理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混匀，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。目前三十二页\总数五十九页\编于六点32影响因素：①转盘转速：破碎比速度与转盘速度成正比。②细胞浓度：最佳浓度应由实验确定。浓度大，产生的热量大，但单位细胞重量所消耗的功率小。③珠粒大小：在一定范围内，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能过小。目前三十三页\总数五十九页\编于六点33④温度：将温度控制在5～40℃对破碎物影响较小。⑤流量：流量大，加工单位质量细胞消耗的能量减小，但细胞的破碎程度和蛋白质的释放量会降低。目前三十四页\总数五十九页\编于六点34

温控与能耗珠磨机是采用夹套冷却的方式实现温度控制的，一般情况下能将温度控制在要求的范围内；珠磨机的能耗与细胞破碎率成正比；高的破碎率会提高分离的成本。目前三十五页\总数五十九页\编于六点352)高压匀浆法（图3-8）作用机理从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的悬液又射击到静止的碰撞环上，被迫改变方向从出口管流出。目前三十六页\总数五十九页\编于六点36

温控与能耗活性物质在破碎过程中的失活问题。蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35ºC以下，酶失活的损失可以忽略。提高压力有利于细胞破碎，但需增加能耗。机械破碎的能耗主要包括提供动力消耗的能量及低温操作消耗的能量。目前三十七页\总数五十九页\编于六点373)超声波法作用机理声频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入可以引起空化现象，使气泡形成、胀大和破碎的现象。目前三十八页\总数五十九页\编于六点38此法多适用于微生物材料、细胞培养材料的破碎；因超声波处理时产热较多，故应用此法时，需要采取降温措施；另外，某些核酸及酶对超声波敏感，慎用此法。目前三十九页\总数五十九页\编于六点39超声波破碎过程效率的影响因素：①声频②声能③处理时间④细胞浓度⑤菌种类型目前四十页\总数五十九页\编于六点40四)化学渗透法

用化学药品改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。作用机理化学渗透取决于化学试剂的类型及细胞壁和膜的结构与组成。不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。目前四十一页\总数五十九页\编于六点41有机溶剂（苯、甲苯）表面活性剂有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）表面活性剂处理法使细胞膜破坏。金属螯合剂（EDTA）变性剂（盐酸胍、脲）目前四十二页\总数五十九页\编于六点42五)酶溶法

用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。溶菌酶、ß-1，3-葡聚糖酶、ß-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等。目前四十三页\总数五十九页\编于六点43作用机理溶酶具有高度专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。目前四十四页\总数五十九页\编于六点44酶溶法的优点：①产品释放的选择性高②抽提的速率和收率高③产品的破坏最少④对pH和温度等外界条件要求低⑤不残留细胞碎片目前四十五页\总数五十九页\编于六点45六)物理法①渗透压冲击法②反复冻融法多用于动物细胞。将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。③低温玻璃化法指从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等成分遭受破坏。目前四十六页\总数五十九页\编于六点46各种破碎方法的比较及选择分类具体方法优缺点及适用范围机械破碎法珠磨法破碎率高，适用范围广，但后处理复杂高压均浆法破碎率高，可大规模操作，适用范围小超声波破碎适用于实验室小规模操作物理破碎法冻融法操作简便，但不适用于对冷冻敏感的细胞低温玻璃化成本高，适用于实验室小规模生产化学渗透法加入特定化学试剂选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但作用时间长，适用范围小酶溶法加入酶选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但成本高，适用范围小目前四十七页\总数五十九页\编于六点47细胞破碎技术的发展方向①多种破碎方法相结合②与下游过程相结合破碎过程要易于细胞碎片的除净。③与上游过程相结合培养基、生长期、操作参数等。目前四十八页\总数五十九页\编于六点48第三节胞内产物的溶解及复性一、包含体及其形成二、包含体的分离和溶解三、蛋白质复性目前四十九页\总数五十九页\编于六点49（一）包含体及其形成

1)包含体的概念在基因工程菌细胞内表达的重组蛋白，常常互相交联在一起，形成不溶性的聚积物，通常称为包含体。目前五十页\总数五十九页\编于六点50包含体在相差显微镜下呈现为许多个高度折光的颗粒，含有这些包含体的大肠杆菌的菌体变大，并出现突起部分。在电镜下，包含体是无明显的膜存在，大致为圆形，直径可达1微米。包含体目前五十一页\总数五十九页\编于六点51包涵体存在于包含体内的重组蛋白通常无生物活性，其形成与否取决于蛋白质的类型。含有二硫键的真核生物蛋白质，在原核生物中进行表达，常常因重组蛋白内及分子间二硫键的错配，而产生无活性的蛋白质，成为不溶性的物质。目前五十二页\总数五十九页\编于六点52包含体形成的原因①产生少量蛋白时，可溶，量过多时，在细胞内超过其溶解度而沉淀；②蛋白质合成速度太快，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影响；目前五十三页\总数五十九页\编于六点53③高表达的蛋白没有形