第六章基因工程的基本技术演示文稿

第六章基因工程的基本技术演示文稿目前一页\总数八十八页\编于九点优选第六章基因工程的基本技术目前二页\总数八十八页\编于九点核酸提取技术凝胶电泳技术PCR技术核酸杂交技术DNA测序技术主要内容目前三页\总数八十八页\编于九点第一节、第二节前章节已介绍目前四页\总数八十八页\编于九点第三节PCR技术目前五页\总数八十八页\编于九点第三节PCR技术PCR基本原理基本过程与反应体系PCR引物设计的原则PCR产物质量的影响因素PCR的种类目前六页\总数八十八页\编于九点中文名称：聚合酶链式反应1、PCR原理：

变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。技术3：PCR技术(polymerasechainreaction)目前七页\总数八十八页\编于九点PCR操作流程94℃50℃72℃目前八页\总数八十八页\编于九点2、

PCR反应过程：变性：DNA双链变为单链；退火：引物与模板结合；延伸：合成互补链；上述过程通过PCR仪的程序设计及自动运作完成。目前九页\总数八十八页\编于九点3、PCR反应体系：体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）

。目前十页\总数八十八页\编于九点1）、引物（寡聚核苷酸）一般成对出现，长度为15-30个核苷酸；

使用浓度：，高达1uM；引物设计原则：G+C含量45-55%；Tm值高于55；引物特异性；引物扩增跨度；是否形成引物二聚体引物的3’端严防错配。目前十一页\总数八十八页\编于九点2）、模板DNA：

基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段；

质量要求：不高3）、Taq酶(热稳定性)：常规酶高保真酶：ExTaqLaTaq酶4）、反应缓冲液成分：

BSA、Tween20、DTT、明胶保护酶作用

Tris.cl提供缓冲作用目前十二页\总数八十八页\编于九点

4、影响PCR产量、质量的因素：(1)

Taq酶：常用1-2.5U/反应（25uL）

浓度低，扩增产物不够；

浓度高，非特异性扩增增加；酶的活性；(2)

dNTP的浓度：常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特异性、保真性；目前十三页\总数八十八页\编于九点(3)模板：主要考虑纯度及使用量对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng；(4)引物浓度：

µmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；(5)

Mg2+浓度：常用mol/L；影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性。目前十四页\总数八十八页\编于九点(6)

PCR反应程序设定1）变性温度和时间：要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃（2小时）95℃（40min）97℃（5min）94℃变性比较彻底，酶的半衰期也不短。2）引物退火温度Tm与时间；

Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃，G、C计为4℃，时间一般为40秒到60秒3）引物延伸温度与时间：

72℃最佳，30-100nt/s，也有用68℃如LaTaq4）循环数：25-35cycles之间，过多则非特异扩增增加；平台效应。目前十五页\总数八十八页\编于九点以普通PCR50lreactionsolution为例)10PCRbuffer25mMMgCl2dNTPMixture(10mMeach)primer1（10M)primer2(10M)Taqpolymerase(5U/l)DNAtemplate(0.1g/l)ddH2Ototal5l(1)4l(2mM)1l(0.1mM)1l(0.2M)1l(0.2M)0.6l(2U/50l)1l36.5l50l5、PCR例子（Exampleofreactionsolution）反应体系配置：目前十六页\总数八十八页\编于九点

PCRthermalprogram94C94CTm72C72C4C1min30sec30sec1min5Cendless30cycles循环数HeatdenaturationHeatdenaturePrimersannealingExtensionLastextensionEndingreactionTa:annealingtemperature设计的反应程序相应作用目前十七页\总数八十八页\编于九点6、PCR的种类RT-PCR特异PCR锚定PCR反向PCR套式PCR不对称PCR长程PCR锅柄PCR免疫PCRRAPD定量PCR原位PCR目前十八页\总数八十八页\编于九点

F

R（1）特异PCR

扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。

（2）RT-PCR：是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。AAAAAAAAAA5`CAPTTTTTTTTTTT目前十九页\总数八十八页\编于九点（3）反向PCR：根据已知序列扩增两侧序列的方法。已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引物1此PCR操作过程：酶切基因组DNA连接环化目的DNA用引物1和引物2组合扩增出侧翼序列目前二十页\总数八十八页\编于九点（4）定量PCR广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义的定量PCR技术是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。用途：分析基因组中某个基因的拷贝数或分析基因的转录表达丰度。目前二十一页\总数八十八页\编于九点指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR技术目前二十二页\总数八十八页\编于九点

原理：通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量X0的对数值与C(T)值之间呈线性关系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN

目前二十三页\总数八十八页\编于九点ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04阈值线Ct值Ct值Ct值的定义

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表thresholdCt值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数（如后图所示）目前二十四页\总数八十八页\编于九点

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10´SDcycle6-15

荧光域值（threshold）的设定目前二十五页\总数八十八页\编于九点

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Ct值与起始模板的关系ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04阈值线Ct值Ct值目前二十六页\总数八十八页\编于九点荧光信号如何产生？1、SYBRGreen12、Molecular

Beacons3、TaqMan相关内容见《分子生物学》目前二十七页\总数八十八页\编于九点原理：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR主要用于分析具有可变末端的DNA序列目前二十八页\总数八十八页\编于九点原理：用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR不对称PCR主要为测序制备ss-DNA，尤为用cDNA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。目前二十九页\总数八十八页\编于九点第四节核酸杂交（印迹）技术目前三十页\总数八十八页\编于九点本节内容印迹基本原理与过程DNA印迹（Southernblotting）RNA印迹（Northernblotting）斑点杂交原位杂交蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术westernblotting（Pr）目前三十一页\总数八十八页\编于九点核酸分子杂交技术是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）技术

杂交分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子；作用：DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系；DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。目前三十二页\总数八十八页\编于九点核酸杂交常用几种膜的性能比较目前三十三页\总数八十八页\编于九点

1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用

2.印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤目前三十四页\总数八十八页\编于九点根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。1、DNA印迹杂交目前三十五页\总数八十八页\编于九点（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern凝胶转移杂交技术过程在进行核酸印迹转移的时：要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤1～2小时；紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。目前三十六页\总数八十八页\编于九点1979年，等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与DNA印迹杂交技术十分类似，又称为Northernblotting。2、RNA印迹技术（Northernblotting）应用：Northern杂交技术应用于特定性状基因在mRNA水平上的动态表达研究。应用于定位克隆中寻找新基因，寻找染色体特定区域的表达序列是大多数人类遗传疾病连锁分析和定位克隆的主要限速步骤，Northern杂交作为寻找这些序列的有效方法，有助于这些疾病候选基因的筛选；目前三十七页\总数八十八页\编于九点斑点印迹杂交是在Southern印迹杂交的基础上发展的一种的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜,NC膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜(除去未接合的探针)，放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。3、斑点印迹杂交（dotblotting）目前三十八页\总数八十八页\编于九点也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。应用：鉴定重组子。4、菌落杂交意义：用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。目前三十九页\总数八十八页\编于九点检测重组体克隆的菌落杂交技术目前四十页\总数八十八页\编于九点5、蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）又叫DNA迁移率变动实验（DNAmobilityshiftassay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。目前四十一页\总数八十八页\编于九点应用：不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA）。可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。

用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）目前四十二页\总数八十八页\编于九点在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用（a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）一样的阻滞条带。凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）

凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。而DNaseⅠ足迹实验可以解决这个问题目前四十三页\总数八十八页\编于九点DNaseⅠ足迹实验是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。DNaseⅠ足迹实验（footprintingassay）如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。目前四十四页\总数八十八页\编于九点原理：DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。而与蛋白结合的DNA片断上的G残基不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片断的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片断，出现了空白区。硫酸二甲酯（DMS）足迹与DNA酶足迹法类似的技术，但不用DNA酶来分解未被蛋白质结合保护的DNA部分，而是用硫酸二甲酯(DMS)来使未受保护的DNA甲基化，DNA可以在甲基化位置被化学降解，DNA分子上与蛋白质紧密结合区内的碱基不能被DMS甲基化。目前四十五页\总数八十八页\编于九点甲基化干扰实验（methyltioninterferenceassay）根据DMS能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。主要局限性：它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。目前四十六页\总数八十八页\编于九点应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验目前四十七页\总数八十八页\编于九点6、Westernblotting原理:与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。过程：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。应用：该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。目前四十八页\总数八十八页\编于九点第五节DNA测序技术目前四十九页\总数八十八页\编于九点本节内容Maxam-Gilbert化学分析法Sanger双脱氧链终止法新发展的DNA杂交测序法目前五十页\总数八十八页\编于九点published:ProcNatlAcadSciUSA,vol741980NobelPrizeChemicalFSangerWGilbert目前五十一页\总数八十八页\编于九点Maxam-GilbertDNAsequencingbychemicaldegradation化学降解法目前五十二页\总数八十八页\编于九点1.Basicprinciple特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5‘或3’)打断磷酸二酯键直接或间接特异性识别4种碱基生成起始于固定起点和终止于特定碱基的一组核苷酸片段目前五十三页\总数八十八页\编于九点G反应：DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。T+C反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。C反应：在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。目前五十四页\总数八十八页\编于九点2.Procedure

TemplatesChemicalreaction

adefinedDNArestrictionfragmentradioactivelylabeledatoneendwith32PRunningPAGE(7Murea)6%~20%CleavagesatspecificbasesAutoradiography目前五十五页\总数八十八页\编于九点目前五十六页\总数八十八页\编于九点5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列目前五十七页\总数八十八页\编于九点dideoxy-mediatedchain-terminationmethodBiologicalmethod目前五十八页\总数八十八页\编于九点DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。（常用Klenow大片段，无5‘→3’外切酶活性）DNAsynthesiswillbeterminated

whenaddNTPisintegratedSanger双脱氧链终止法的基本原理目前五十九页\总数八十八页\编于九点3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,

ddCTP,

ddGTP,ddTTPCATCGTACATCGTACGTAGCATCGTACCATCGTACGCATCGTACGTCATCGTACGTATemplateCATCGTACGTAGCprimer目前六十页\总数八十八页\编于九点A:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddCTPT:dNTP+ddTTPGATC5AAATCGTCGTCATCTAAAATACGAATACGTTGAAAGTGGGTAAG3目前六十一页\总数八十八页\编于九点测序步骤①用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。②选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。③引物先同单链模板复性。④在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不同的ddNTP。⑤进行聚合反应，DNA新生链延长，当掺入ddNTP时，聚合反应终止。⑥在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。⑦根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出DNA序列。目前六十二页\总数八十八页\编于九点目前六十三页\总数八十八页\编于九点5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列目前六十四页\总数八十八页\编于九点新发展的DNA测序技术目前六十五页\总数八十八页\编于九点DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。自动测序仪的设计原理是采用荧光标记DNA片段，并用激光激活的荧光探测系统，检测序列反应的分离产物，读出电泳条带所示的碱基顺序。分离产物有两种基本方法：单荧光标记四泳道分离和四荧光标记的单泳道分离。

特点目前六十六页\总数八十八页\编于九点测序原理ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的引物，4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。目前六十七页\总数八十八页\编于九点ddGTPddATPddTTPddCTPKeytechniqueLabelingddNTPwith4kindofdRhodamine

EachdRhodaminegivedifferentcolor目前六十八页\总数八十八页\编于九点2.测序步骤目前六十九页\总数八十八页\编于九点A:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddCTPT:dNTP+ddTTP目前七十页\总数八十八页\编于九点目前七十一页\总数八十八页\编于九点计算机排序5ˊ目前七十二页\总数八十八页\编于九点目前七十三页\总数八十八页\编于九点Strategy

for

sequencingaDNAfragment1.Primerwalking2.Randomclones目前七十四页\总数八十八页\编于九点1.PrimerwalkingSynthesizingoligo-nucleotides一次测序反应一般可读出600～800bp，若待测序的DNA片断较大，则需从多处不同的位置引导测序反应。目前七十五页\总数八十八页\编于九点2.Randomclones对于更大的目标片段：一次测序反应一般可读出600～800bp，若待测序的DNA片断非常大，则可以将目标片段打断，然后进行随机克隆，构建能够覆盖其全长的文库，然后对这些文库进行测序，获得一系列打断的片段序列，最后通过拼接获得全长序列。目前七十六页\总数八十八页\编于九点目前七十七页\总数八十八页\编于九点SolexaSOLiD新一代高通量测序技术目前