HPLC测定长清不同品系瓜蒌皮中腺嘌呤、鸟嘌呤-第三军医大学学报

#栝楼果皮不同生长期多指标化学成分动态积累

的分析与评价基金项目：“山东道地药材资源质量控制科技平台建设”课题(2008GG2NS02022)；山东省农业良种工程“道地中药材种质资源收集、保存与整理”课题(2009LZ01-03)；济南市科技局高校院所自主创新项目“山东道地药材长清栝楼种质资源收集、整理与良种选育研究”课题(基金项目：“山东道地药材资源质量控制科技平台建设”课题(2008GG2NS02022)；山东省农业良种工程“道地中药材种质资源收集、保存与整理”课题(2009LZ01-03)；济南市科技局高校院所自主创新项目“山东道地药材长清栝楼种质资源收集、整理与良种选育研究”课题(200906028)资助。作者：于京平(1984-)，女，山东烟台人，山东中医药大学中药学专业2011级中药学博士研究生，方向中药资源及其质量控制研究，yujingping69@163.com。通讯作者：张永清(1962-)，男，山东平邑人，理学博士，教授，博士生导师，从事中药资源及其质量控制研究，zyq622003@126.com。(1.山东中医药大学济南250355)［摘要］目的对栝楼果皮不同生长期化学成分动态积累进行分析评价。方法采用高效液相色谱法对栝楼果皮不同生长期腺嘌呤、鸟苷、瓜氨酸等成分进行测定。结果不同生长期三种化学成分含量变化较大。结论综合评价提示果皮表面颜色基本为黄色仅维管束凸起处为绿色时适宜采收山东长清产瓜蒌皮药材。［关键词］栝楼果皮；化学成分；动态积累中图分类号:R282AnalysisandEvaluationforDynamicAccumulationofMulticriteriaChemicalCompositionsfromthePeelofTrichosantheskirilowiiMaxim.inDifferentGrowthPeriodsJingpingYu1,YongqingZhang1*1ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Ji'nan250355,China;Abstract:ObjectiveToanalyzeandevaluatethedynamicaccumulationofmulticriteriachemicalcompositionsfromthepeelofTrichosantheskirilowiiMaxim.indifferentgrowthperiods.MethodsTheadeninecontent,theguaninenucleosidecontent,thecitrullinecontentfromthepeelofTrichosantheskirilowiiMaxim.indifferentmatureperiodsweredetectedbyHPLC.ResultsThechemicalcompositionsfromthepeelofTrichosantheskirilowiiMaxim.indifferentgrowthperiodsdifferedsignificantlyConclusionThePeelcolorisyellowonlyvascularprojectionisgreenissuggestedtobethebestpickingtimeforthepeelofTrichosantheskirilowiiMaxim.Keywords:ThepeelofTrichosantheskirilowiiMaxim.chemicalcompositions；dynamicaccumulation；栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim.为葫芦科多年生草质藤本植物，其干燥成熟果皮是常用中药瓜蒌皮，可清热化痰、利气宽胸，具有抗心律失常、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等药理作用；临床常用于治疗肺热咳嗽、痰浊黄稠、胸痹心痛、肺痈等［1-2］。有关瓜蒌皮的活性成分至今不明确，现行《中华人民共和国药典》仅收载了以对照药材薄层定性的鉴别方法，控制瓜蒌皮药材质量尚缺乏合理指标。以瓜蒌皮为原料研制生产的瓜蒌皮注射液具有行气除满、开胸除痹之功效［3-4］。我们研究发现，腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、瓜氨酸是瓜蒌皮注射液中存在的主要成分之一。现代研究显示，腺嘌呤与鸟苷、瓜氨酸均具有明显的药理活性。腺嘌呤可提高红细胞携氧和放氧能力，与磷酸的结合物可刺激白细胞增生，用于防治白细胞减少症［5］；鸟苷可改善心脑血液循环，具有防止心率失常、抗肿瘤、抗病毒等活性［6-7］。瓜氨酸在体内转化为人体必需氨基酸：L-精氨酸，在维持心血管正常功能的一氧化氮代谢中发挥着重要作用［7］。因此，在活性成分尚不明确的情况下，可以将腺嘌呤、鸟苷、瓜氨酸作为瓜蒌皮药材质量的控制指标。中药材采收期对保证中药材质量有重要意义，若采收期适宜，则可保证中药材中的药用部分产量和有效成分含量都达到较高水平。目前，有关采收时间对瓜蒌皮药材产量质量的影响等方面的研究几乎为空白。本文在统一种质的前提下，选取腺嘌呤、鸟苷、瓜氨酸等化学成分作为指标，对栝楼果皮不同生长期化学成分的动态积累进行分析，为确定瓜蒌皮药材的适宜采收期提供科学依据。材料仪器Agilent1200高效液相色谱仪；WatersAtlantisT3-C18(4.6mmx150.0mm，5pm)；AgilentTC-C18(4.6mmx250.0mm，5^m)；超声仪；电热恒温干燥箱；电子天平。瓜蒌皮药材所用材料采自山东中医药大学药用植物园，经山东中医药大学张永清教授鉴定，确认为葫芦科栝楼属植物栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim.。自7月3日幼果期，在健壮枝条的中段选择花后发育天数相同的栝楼幼果，挂牌标记。自7月3日幼果期到10月26日果实成熟期共采样11次，采样时间统一定在晴朗的上午8：00时左右。不同生长期栝楼果皮的采收时间及外观性状见表1、图1。表1不同生长期栝楼果皮的采收时间及外观性状采收时间 外观性状2013年7月3日嫩绿色，果皮表面有毛绒。2013年7月8日果皮表面绿色程度增大，硬度增大、果皮表面变粗糙。2013年7月18日果皮表面绿色程度增大，硬度增大、果皮表面变粗糙。2013年7月28日果皮表面绿色程度增大，硬度增大、果皮表面变粗糙。2013年8月17日果皮绿色，硬度增大、果皮表面变粗糙。

2013年2013年9月7日2013年9月16日2013年9月26日果皮绿色，硬度增大、果皮表面变粗糙。果皮颜色泛黄，果实变软，出现维管束凸起。2013年10月6日2013年10月16日2013年10月26日果皮颜色基本为黄色，果实变软，仅维管束凸起处为绿色。果皮颜色为黄色，果实变软。果皮黄色程度增大，果实变软，果皮表面皱缩深。图1果皮颜色基本为黄色，果实变软，仅维管束凸起处为绿色。果皮颜色为黄色，果实变软。果皮黄色程度增大，果实变软，果皮表面皱缩深。试剂腺嘌呤、鸟苷对照品购自美国ACROSORGANICS公司，瓜氨酸对照品购自中国药品生物制品检定所，经HPLC-UV检测纯度均达98%以上；邻苯二甲醛（色谱级）；一氯甲酸芴甲酯（色谱级）；乙腈（色谱级）；甲醇（色谱级）；纯净水。方法核苷类成分的测定色谱条件色谱柱：Atlantis"（Waters）（5^m,4.6mmx150mm）；流动相：水-甲醇;柱温为室温；检测波长：254nm；进样量：50出。参见表2。表2流动相梯度洗脱程序t/min甲醇（%）水（%）001001501003510906030702.1.2对照品溶液制备精密称取一定量减压干燥至恒重的鸟苷、腺嘌呤对照品，加15%甲醇溶解，转移至20ml容量瓶中，定容，混匀，配制成腺嘌呤浓度为0.0310mg/ml、鸟苷浓度为0.0704mg/ml的对照品溶液；以0.45m滤膜滤过，取续滤液备用。样品溶液制备将瓜蒌皮置于55℃条件下烘干，粉碎，过四号筛。四分法取样，精密称定适量干燥粉末，置具塞瓶中，加15%甲醇10ml，称重；50℃温浸1h，50℃超声提取1h，冷却，用15%甲醇补足重量，离心10min（4500rpm），取上清液，重复提取2次，合并上清液，用0.45m滤膜滤过，即得。样品测定分别精密吸取对照品溶液与样品溶液50〃1按上述色谱条件测定其峰面积积分值，以外标法计算样品溶液中的鸟苷、腺嘌呤含量，重复3次。线性关系考察及标准曲线制备腺嘌呤、鸟苷对照品系列浓度溶液，分别精密吸取50出进样，按2.1.1项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），以对照品实际进样量（mg）为横坐标（X），绘制标准曲线，见表3、图2。表3对照品的标准曲线对照品 标准曲线 R2腺嘌呤Y=8800000X-7.20621.0000鸟嘌呤核苷Y=3500000X+6.86331.0000

鸟嘌呤核苷腺嘌呤. 」Ip111I1111I1111I110 10 20 30min瓜氨酸的测定色谱条件色谱柱：AgilentTC-C18柱（4.6mmx250.0mm,5^m）；流动相：取醋酸钠10.88g,力口水4000ml使溶解，加三乙胺0.8ml,四氢呋喃24ml,混匀，用2%冰醋酸溶液调节pH值至7.20,即得流动相A；取醋酸钠10.88g，加水800ml使溶解，用2%冰醋酸溶液调节pH值至7.20,加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混匀，即得流动相8。柱温：25℃；检测波长：338nm；进样量：50”。快速柱前衍生化反应：供试品和对照品溶液在pH10.2的硼酸缓冲液中首先和1%邻苯二甲醛（OPA）反应，再用0.5%一氯甲酸芴甲酯（FMOC）溶液进行衍生。表3流动相梯度洗脱程序t/min流动相A流动相B流速（ml/min）0100018928122861413173271.53871291.55421791588515160100012.2.2对照品溶液制备精密称取一定量减压干燥至恒重的瓜氨酸对照品，加水溶解，转移至20ml容量瓶中定容，混匀，配制成浓度为）.368mg/ml对照品溶液；以0.45Rm滤膜滤过,即得。样品溶液制备精密称定适量干燥粉末，置具塞瓶中，加水10ml,称重；50℃温浸1h,50℃超声提取1h,冷却，用水补足重量，离4l0min（4500rpm）,取上清液，重复提取2次，合并上清液，用0.45um滤膜滤过，即得。样品测定分别精密吸取对照品溶液与样品溶液50〃1，按上述色谱条件测定其峰面积积分值，以外标法计算样品溶液中的瓜氨酸含量，重复3次。线性关系考察及标准曲线制备瓜氨酸对照品系列浓度溶液，分别精密吸取50出进样，按2.2.1项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），以对照品实际进样量（mg）为横坐标（X），绘制标准曲线，见表4、图3。表4对照品的标准曲线对照品标准曲线R2瓜氨酸Y=2000000X-1.36751.0000精密度试验精密吸取对照品溶液，按1.5.1、2.5.1项下色谱条件，测定腺嘌呤、鸟苷、瓜氨酸峰面积，重复5次，其峰面积RSD分别为1.17%、1.31%、1.60%，表明精密

度良好。稳定性试验精密吸取样品溶液，在10h内测定腺嘌呤、鸟苷、瓜氨酸峰面积5次，其峰面积RSD值分别为2.12%、1.12%、1.00%，表明样品溶液在10h内稳定。重复性试验精密称取药材粉末，分别按照1.2.3、1.2.3项下方法同时制备5份，分别测定腺嘌呤、鸟苷、瓜氨酸含量，其RSD均小于5%，表明重复性良好。加样回收率试验精密称量已知鸟苷、腺嘌呤、瓜氨酸含量的样品1.000g，共6份，分别加入一定量的对照品，分别按照1.2.3、1.2.3项下方法制备，按2.2.1项下色谱条件测定鸟苷、腺嘌呤、瓜氨酸含量，按回收率=(C-A)/Bx100%(A为样品中所含被测成分量；B为加入对照品量；C为实测值)计算回收率，结果鸟苷、腺嘌呤、瓜氨酸对照品回收率均值分别为101.20%、100.67%、100.15%，其RSD分别为1.63%、1.91%，1.70%，表明鸟苷、腺嘌呤、瓜氨酸对照品回收率符合要求。2结果与分析不同生长期栝楼果皮鸟嘌呤核苷、腺嘌呤含量的测定及比较对栝楼果皮生长发育过程中鸟苷、腺嘌呤含量进行动态测量，变化情况动态如图4。1.43CC—膝餐吟舍虽-■-鸟昔舍星mo1.43CC—膝餐吟舍虽-■-鸟昔舍星moi.□I最3m-Bncfm爵或rHumEmgmsncsmsgma哎。一mUD/6m巴底6m-一吹6m寸哎E哎bm一於gmsncwm曷或m曷或0_nW6或口一Ln最。一EnGZnqEEn巴呼En二或mEn寸丈6En出职H«/Rmb一明叩①最叩团吊灰一msKiml叵mo-呼HI图4不同生长期栝楼果皮腺嘌呤、鸟嘌呤核苷含量的变化由图4可以看出，生长发育前期鸟嘌呤核苷、腺嘌呤含量总体呈下降趋势，9月中旬果实体积、重量基本达到最大时，两者含量达到最低点；之后鸟苷、腺嘌呤快速积累，至果皮表面颜色稍微泛黄时，腺嘌呤含量达到最高值0.1893mg/g,至果皮表面颜色基本全黄、仅维管束凸起处为绿色时鸟苷含量达到最高值0.4128mg/；g随着果实进一步成熟，两者含量均出现下降，表现出随着果实成熟度增加而下降的变化趋势。果实生长初期，单果果皮中鸟苷、腺嘌呤总量持续累积，直至果皮表面稍微泛黄时均达到最高，分别达9.5148mg、4.3709mg，随着果实进一步成熟，两者含量开始下降，表现出随着果实成熟度增加而下降的变化趋势。不同生长期栝楼果皮瓜氨酸含量的测定及比较对栝楼果皮生长发育过程中瓜氨酸含量进行动态测量，变化情况动态如图5。16.000014.0000一感氨酸含量12.000010.0000GFS.OOTO6.16.000014.0000一感氨酸含量12.000010.0000GFS.OOTO6.(XXX)Ln其H7[□二歌L号把ml350.00003OT.OTOO350.00003OT.OTOO^00.0000*^150.0000100.000050.0000-O.OTOOI*一।50.0000-O.OTOOI*一।率T-单里感室窿管壁[nsnEB□I最O0EQ-EnEfEn翁丈1□I二%[nsnEfLn1由图5可以看出，瓜氨酸含量短暂升高之后平稳降低，8月17日达到最低仅为0.4492mg/g，之后呈现逐渐升高，至果皮颜色基本为黄色仅维管束凸起部分为绿色，此时瓜氨酸含量达到最高值12.8834mg/g，随着果实进一步成熟至果皮表面颜色基本全黄含量下降，至栝楼果实完全成熟果皮表面皱缩时含量稍微上升。对单果栝楼果皮中瓜氨酸总量的动态变化规律进行研究，随着果实生长持续升高，当栝楼果皮表面颜色基本为黄色，仅维管束凸起部分为绿色，此阶段达到最高值297.2093mg，随着果实进一步成熟含量出现下降，至果皮完全成熟表面出现皱缩含量稍微上升。3讨论与小结栝楼果实生长动态栝楼果实植物果实从形成到成熟呈现出生长动态规律变化，经历果实重量、果实体积、果实长、果实直径的增大、果实变软、果皮颜色变化等一系列变化。9月26日果皮颜色稍微泛黄标志着栝楼果实进入转色期。栝楼果皮生长过程中化学物质积累动态我们系统研究栝楼果皮整个生长周期多种化学成分含量变化规律，进一步探讨栝楼果皮化学物质积累与生长发育的关系。果皮中腺嘌呤含量在果皮颜色微黄时达到最高；鸟苷、瓜氨酸含量在果皮颜色基本全黄仅维管束凸起处为绿色时达到最高；由于不同生长期栝楼果皮重量相差较大，为更全面分析栝楼果皮整个生长周期多种化学物质变化规律，我们将化学成分含量与特定时期果皮重量相乘得出单果栝楼果皮中多种化学成分总量。实验结果表明，单果果皮中鸟苷、腺嘌呤总量在果皮颜色微黄时达到最高；瓜氨酸含量在果皮颜色基本全黄仅维管束凸起处为绿色时达到最高；总的来说未完全成熟的栝楼果皮中的化学物质含量高于完全成熟的栝楼果皮，多种化学成分含量变化与果皮颜色转变密切相关。采收期的确定采收是药材生产过程中的重要环节,直接影响着瓜蒌皮药材的质量与产量，中药材的采收应综合考虑有效成分含量和产量的动态变化，最大限度保证中药材中的药用部分产量和有效成分含量均达到较高水平。针对栝楼果皮采收期没有明确记载，传统采收期多以栝楼果实为目标产物［8-9］，栝楼果皮采收期与有效成分的动态累积有何内在关联，亦未见系统研究报道。结合实验结果我们认为果皮颜色未转黄之前是栝楼果皮生长和积累的重要时期，不宜采收；栝楼果皮应于10月初果实尚未完全成熟时、果皮表面颜色基本为黄色仅维管束凸起处为绿色时采摘，此阶段栝楼果皮产量及化学成分总量均达到最高峰；不宜过迟，否则果实老熟，皮薄，产量质量均下降。不同采收时间瓜蒌皮药材质量有明显差异，获得高产质优的瓜蒌