疾病相关基因的发现及功能研究演示文稿

疾病相关基因的发现及功能研究演示文稿目前一页\总数九十一页\编于十点（优选）疾病相关基因的发现及功能研究目前二页\总数九十一页\编于十点人类基因组及表达概况人类单倍体基因组由3.2xl06bpDNA组成，含有2～3万个基因在一般情况下任何类型的细胞大约只表达一部分基因，约产生5000-15000种蛋白质每一特定发育时期或每种组织特异表达其基本与独特的蛋白质正常成人体内约含有250种以上不同类型细胞目前三页\总数九十一页\编于十点每种细胞大约表达300—400种不同于其他细胞的特异性蛋白质脊椎动物细胞总蛋白的35％80％在各种组织之间互不相同而构成所谓标志蛋白，也称看家基因如糖代谢、DNA修饰和蛋白合成等有关酶的选择性表达基因多为低丰度的基因我们对其中绝大部分基因及表达产物功能尚不了解，在疾病中的意义不明目前四页\总数九十一页\编于十点基因的表达调控基因的表达主要是通过：控制转录转录的启动转录的速度转录后的修饰控制翻译实现翻译的启动翻译后的修饰目前五页\总数九十一页\编于十点基因差异性表达的研究策略目前六页\总数九十一页\编于十点转录水平：差异性表达mRNA水平分析

DDRT-PCR技术差减杂交抑制差减杂交基因表达系列分析(SAGE)翻译水平:proteinelectrophoresis目前七页\总数九十一页\编于十点转录水平目前八页\总数九十一页\编于十点方法基本要求寻找mRNA表达的差异,至少要满足下列要求在一定时、空里,约有15000种mRNA表达/cell,除少数属高丰度、大量的属于低丰度表达,使用的方法足以显示低丰度mRNA重复性要好实验过程中能够步步验证比较得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs,并能由此找到相应的cDNA序列省时,简便易行目前九页\总数九十一页\编于十点A、差减杂交(subtractivehybridization)差减杂交是利用目的基因在两种组织或细胞中表达的差异，通过其mRNA或单链cDNA进行液相杂交，除去两者之间相同的基因成分取得。目前十页\总数九十一页\编于十点ControlExperimentmRNART→cDNA标记生物素不标记生物素目前十一页\总数九十一页\编于十点Hybridization生物素亲和层析柱未结合的洗脱下来克隆、测序得到差异表达基因目前十二页\总数九十一页\编于十点优点利用降低了复杂度的差减文库进一步作差异杂交，能够显著提高差异杂交的效率缺点目的基因片段的富集程度有限假阳性比例较高需大量的mRNA(>20mg)目前十三页\总数九十一页\编于十点B、抑制差减杂交(supressionsubtractivehybridization,SSH)原理：以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交方法：利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅一柄”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增目前十四页\总数九十一页\编于十点TestControlmRNART→cDNARsaI/HaeIII酶切目前十五页\总数九十一页\编于十点TestcDNA分成两部分连上接头加入过量的controlcDNA变性后杂交连上接头目前十六页\总数九十一页\编于十点第一次杂交

第一次杂交后有4种产物：a是单链testcDNAb是自身退火的testcDNA双链C是test和control的异源双链d是单链controlcDNA目的第一次杂交是使test单链cDNA均等化，使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致目前十七页\总数九十一页\编于十点原理丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA.目的由于testcDNA中和controlcDNA序列相似的片段大都和control形成异源双链分子C，使testcDNA中的差异表达基因的cDNA得到大量富集目前十八页\总数九十一页\编于十点第二次杂交合并两份杂交产物，另加上新的变性control单链，再次杂交退火只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链testcDNA能与controlcDNA一起形成各种双链分子这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA,并产生了一种新的双链分子e，这种分子的两个5'端有两个不同的接头，正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效地扩增。目前十九页\总数九十一页\编于十点巢式(Nest)PCR两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR(nestedPCR)原理进行扩增e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高c型的双链分子只在一端有一个引物配对，扩增效率比e型分子低得多b型分子由于两端有长序列的反向重复，可互补形成牢固的“锅一柄”二级结构，无法进行有效扩增e就是差异表达的基因目前二十页\总数九十一页\编于十点抑制消减杂交法的优点降低假阳性率两步杂交和两步PCR，保证了该方法具有较高的特异性具有高度敏感性：它的均等化和对目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也有被检测的可能目前二十一页\总数九十一页\编于十点抑制消减杂交法的缺点该方法若是mRNA量不够，那么低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会检测不到其次，消减库中的cDNA因为已被限制酶消化，不再是全长cDNA步骤繁琐，工作量大目前二十二页\总数九十一页\编于十点C、限制型差异显示PCRmRNA反转录成双链cDNA再用同一限制酶(首先识别4bp的酶)消化cDNA并把酶切片段分别加上接头后进行特异PCR扩增获得差异表达片段目前二十三页\总数九十一页\编于十点优点通过使用限制酶将cDNA杂交度降低降低了杂交后无关重复序列对富集的靶序列的污染假阳性率相对低得多目前二十四页\总数九十一页\编于十点缺点但RDA无法检测缺乏合适内切酶位点的表达序列类似抑制差异杂交技术，它只能获得较短的靶基因探针，用几个甚至几十个探针分别去筛选全长cDNA绝不是一件容易的事情另一方面cDNARDA降低复杂性也可能造成一些信息的丢失目前二十五页\总数九十一页\编于十点D、mRNADDRT-PCRmRNAdifferentialdisplayRT-PCRThreetechniquesRT:Reverse-Transcription:PCR:PolymeraseChainReactionPAGESequencegelelectrophoresis目前二十六页\总数九十一页\编于十点ControlExperimentmRNARTPCR目前二十七页\总数九十一页\编于十点PAGEelectrophoresisControlExperimentDownregulatedgeneUpregulatedgene目前二十八页\总数九十一页\编于十点DifferentialDisplaygeneT-cloneSequenceInformaticsanalysis目前二十九页\总数九十一页\编于十点VerifyNorthernblotRT-PCRTraltimeRT-PCRConclusion目前三十页\总数九十一页\编于十点GenefunctionanalysisOverexpressionRNAiTissuedistributionSub-celllocationKnockoutTransgeneInvitroanalysisInvivoanalysisImmunohistologyConfocal&Microscopy目前三十一页\总数九十一页\编于十点优点

同其他方法相比较微量样品：仅需0.2μg总RNA作为起始材料高通量：可同时分析多组样品敏感性：高,可检出低丰度mRNA实验周期：短,约8天即可完成,便于重复脚踏实地：步步验证比较可简单地将DD的特点概括为“3SRV”,即“Simplicity,Sensitivity,Speed,Reproducibility,Versatility”

目前三十二页\总数九十一页\编于十点

同其他方法相比较一是假阳性多(约50%～70%)二是得到的有差异cDNA片段短(约为110～500bp)缺点目前三十三页\总数九十一页\编于十点假阳性的原因提取总RNA时,有染色体DNA污染,此DNA作为模板在PCR过程中被扩增从聚丙烯酰胺胶上挑选有差异条带时,实验组与对照组间信号对比不够显著在克隆阶段挑选阳性菌落时,未能排除基因克隆中的假阳性研究中多次使用PCR技术,很难避免实验室环境中的交叉污染目前三十四页\总数九十一页\编于十点解决方法提取RNA操作严格,得到的RNA必须经过脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化,去除染色体DNA污染切取有差异条带时,首选实验与对照间信号差异显者,最好是互为有或无的关系;仅仅是强与弱的关系,放在次选位置上即使是差异显著地显现为一条带,也不能肯定是由某一cDNA的均一分子泳动而成,有可能是结构不同而分子量相同的cDNA共泳动的结果交叉污染问题的克服应服从分子生物学一般原则金标准：差异基因最终确认用Northern杂交目前三十五页\总数九十一页\编于十点其它方法基因表达系列分析(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)DNA芯片(DNAChips)几种方法的综合运用目前三十六页\总数九十一页\编于十点翻译水平差异表达研究策略目前三十七页\总数九十一页\编于十点蛋白质水平分析蛋白质组学：一个蛋白质组是由一个基因组或任何细胞／组织表达的所有种类蛋白质同一种mRNA可因不同的剪接或翻译后加工产生多种蛋白质，故一个蛋白质组的蛋白质数量可超过相应基因组的基因数目目前三十八页\总数九十一页\编于十点蛋白质组学研究常用技术二维凝胶作图(2D—gelmapping)：二维凝胶作图是在同一块凝胶上，一个面上依据蛋白质的等电点(pI)，另一面上依据蛋白质的分子量进行电泳，将各种不同蛋白质分开，这种方法可同时分析数千种蛋白质凝胶的高分辨率和高度重复是运用二维凝胶电泳分离许多种复杂蛋白质混合物的前提目前三十九页\总数九十一页\编于十点二维凝胶作图方法2种方法：垂直平板凝胶(verticalslabgels)超薄水平凝胶(ultra-thinhorizontalgels)均采用梯度凝胶(9-16％聚丙烯酰胺)，可分离5--200kD蛋白目前四十页\总数九十一页\编于十点检测根据实验目标和所需灵敏度采用银染、考马氏亮蓝或放射自显影检测采用激光密度扫描(laserdensitometer)、磷显影仪(phosphor-imager)等扫描装置目前四十一页\总数九十一页\编于十点结果分析目前四十二页\总数九十一页\编于十点二维凝胶参照图谱(2D-gelreferencedmaps)利用电子计算机分析构建二维凝胶参照图谱最后通过微测序、肽图(peptidmapping)、免疫和cDNA短暂超表达等研究最后确立蛋白质结构，并与蛋白数据库及DNA数据库的信息进行比对、分析得出结论目前四十三页\总数九十一页\编于十点脑缺血/缺氧相关基因的克隆目前四十四页\总数九十一页\编于十点研究背景、目的脑缺血（缺血性中风）特点：常见病、多发病、高致残率、高死亡率，年新发病例超过150万脑缺血致脑损伤机理:自由基、能量消耗、兴奋性氨基酸毒性、钙超载、细胞凋亡学说目前存在的问题：脑缺血发病机理复杂、涉及的许多环节尚未完全阐明、作用靶点缺乏特异性，临床疗效不佳。目标：寻找新的靶点体内存在脑缺血保护性因素，我们的研究目的就是揭示和阐明这些内在保护性机制，寻找新的预防和治疗脑缺血的靶点目前四十五页\总数九十一页\编于十点研究技术路线

制作MCAO大鼠脑缺血模型↓荧光差异显示PCR

↓

脑缺血相关差异显示EST片段的获得↓

差异显示EST片段的筛选确认

↓

获取目标基因全长

↓

生物信息学分析研究

↓↓

制备抗体基因表达的功能研究

↓过表达RNAi转基因动物

↓↓↓↓

组织表达谱分析体内外体内外子代性状研究

目前四十六页\总数九十一页\编于十点

动物：250-280gSD雄性大鼠。采用MCAO(MiddleCerebralArteryOcclusion)大脑中动脉栓塞模型：TTC染色结合动物行为学改变确认模型成功取大鼠脑缺血2小时

缺血侧组织非缺血侧组织进行研究脑缺血模型的制作RLR:ischemia;L:non-ischemiaStainwithTTC目前四十七页\总数九十一页\编于十点缺血与非缺血组织RNA的提取提取RNA的纯度和完整性纯度检验：

A260/A280＝1.96

完整性检验：电泳结果见图2Fig2TheelectrophoresisofRNAofcerebralischemiaandnon-ischemia目前四十八页\总数九十一页\编于十点

差异显示PCR结果(图谱)目前四十九页\总数九十一页\编于十点NumberAlignmentresultfromGenBankNumberAlignmentresult81Homosapiensnuclearmatrixprotinp8425New10Cysteinedioxygenase54New12MusmusculusCCR4-NOTtranscriptioncomplexR51NewR34Musmusculusab1-interactor1R66NewR41HomosapiensCG-99proteinR81NewR71MIR16R92NewR101Tissueinhibitorofmetalloproteinase3geneR111NewR162Homosapiensnuclearreceptorco-repressorR122NewR123Tissueinhibitorofmetalloproteinase3geneR132NewR18PeptideChainReleaseFactor1R19BACcloneRP24-462J14fromchromosome19部分差异片段测序结果表

1FDDRT-PCR差异显示EST序列同源性分析结果(2001年分析结果).Tab.1TheblastresultsofsequenceassayfromdifferentialdisplaybyFDDRT-PCR.目前五十页\总数九十一页\编于十点小结共获得了146个与脑缺血相关的EST片段。其中9个为新的EST片段。目前五十一页\总数九十一页\编于十点脑缺血相关基因YZ-2的筛选及确认目前五十二页\总数九十一页\编于十点差异显示基因初筛Fig4,5,6RT-PCRscreening(20fragment)采用RT-PCR技术进一步验证已经克隆的EST片段的在脑缺血中的差异表达456目前五十三页\总数九十一页\编于十点反相NorthernBlot印迹分析结果Fig9PartialDotNorthernBlotanalysis目前五十四页\总数九十一页\编于十点差异表达EST片段的生物信息学分析Fig3BlastanalysisresultsfromGeneBank目前五十五页\总数九十一页\编于十点片段R6RT-PCR的结果R6β-actinM:Marker;Lane1:Non-ischemia;Lane2:β-actin;Lane3:Ischemia;Lane4:β-actinFig8RT-PCRresultofR6(n=6)*P<0.001Fig9ThevolumeratioofR6andβ-actinbandinRT-PCR目前五十六页\总数九十一页\编于十点R6片段的RT-PCR半定量分析结果表

2R6与β-actinRT－PCR扩增产物的灰度扫描体积比值

Table2ThevolumeratioofR6andβ-actinbandinRT-PCRGroupnVR6/mm3

Vβ-actin/mm3VR6/mm3/Vβ-actin/mm3Ischemia6382910±5892

201876±2374

1.8968±0.2356*Non-ischemia6109823±1562213875±31220.5135±0.1021

Comparewithnon-ischemia*P<0.001目前五十七页\总数九十一页\编于十点大鼠脑缺血相关基因EST片段R6的确定Fig

10PartialFDDRT-PCRResultsFig112002-3-5BlastResultFig12DotblotResultsFig13RT-PCR101112R6β-actin13

小结目前五十八页\总数九十一页\编于十点YZ-2基因全长的克隆目前五十九页\总数九十一页\编于十点

利用5‘RACE技术克隆R6全长

5’RACE主要步骤

RNA的制备

↓

片断特异引物反转录成cDNA↓RNA连接酶环化

↓

NestPCR反应↓产物TA克隆测序

Fig14Mechanismof5’RACE目前六十页\总数九十一页\编于十点

第一轮5‘RACE引物的设计RT：5’-TGGTGTCTAATGCTC-3’

F1：5'-AGGTCTTAGGTTCCTTTTGAGTCTG-3’R1：5'-GTGCTTGCTGACATGTACTGTTGC-3’GCAACAGTACATGTCAGCAAGCACS2：5’-CCTTCTCTTTGTAAGTTCTGTTGAG-3’A2：5’-ATAGCCATACTGTTCCCTAGCAG-3’CTGCTAGGGAACAGTATGGCTAT

5’ATTACAGGCAAATTGGGCATACTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTTAAATACTTGGCGTAATCATGGTNATACTTGTTTCTGTGTGAAACAGGACTGCTAGGGAACAGTATGGCTATTATAAAACACCTTTCAAGTATGAACTGCATGTTTGTTCAATGTCTTTCCGGTGGAATAATTCCTAGCAAGCAACAGTACATGTCAGCAAGCACATGTGTTGAAGGCTAAGATATAAATTTTGAAAAACTACAATAGNAACAAAAGTAAAGGTCTTAGGTTCCTTTTGAGTCTGTCAACCACACACTATTATATTAAATTGTCATTATTATTTTCATAGAAGAAAATGTATATTATTTCTTTTGATCTTTACAGGACATGAATAGAAATAATGTTTATTTATATAGAACCTAAGCAAAAATCCTCATATATATGTTCAAGTCATCACAGCATGAGTAATTTTGAAGTTTTAACTCACCCCCCTTCTCTTTGTAAGTTCTGTTGAGCATTAGACACCAGTAAAANTATTTTAAACCCGAAAAAAAAAA

3’目前六十一页\总数九十一页\编于十点NestPCR产物的电泳图15Fig151stPCRofNestPCRFig162ndPCRofNestPCRM:marker;Control:BlankControl;R+F:Upper+lowerprimer;F:Upperprimer;R:lowerprimer16目前六十二页\总数九十一页\编于十点RACEPCR产物的克隆及酶切鉴定按照常规方法进行凝胶回收与T载体的连接重组质粒的转化重组质粒DNA的抽提及酶切鉴定(见图17)Fig17TAsubcloneandIdentifypositiveclonesbyrestricatedenzymeEcoRIdigestion.

Lane1,2,3,4:TheplasmidwerenotdigestedbyEcoRI.

LaneM:Marker.Lane5,6,7,8:Thelane1andlane2plasmidsweredigestedbyEcoRI.

目前六十三页\总数九十一页\编于十点第一轮测序图谱Fig18Sequenceresultsofproductfromfirst5’RACE

目前六十四页\总数九十一页\编于十点NorthernBlot印迹分析结果Fig19Northernblotresults.LaneM:markerLaneR6:ischemialateral

目前六十五页\总数九十一页\编于十点22NorthernBlot确认YZ-2差异表达Fig22:Afterusingnon-DIGlabeledprobe:DIGlabeledprobe=50:1

2021Fig20:BeforehybridizationLaneL:Nonischemia;LaneR:IschemiaFig21:Afterhybridization目前六十六页\总数九十一页\编于十点第二轮RACE引物设计Northern印迹分析我们尚未获取YZ-2基因全长，在首轮RACE的序列靠近5‘端的位置设计引物。RT：5’-CCAAATGAAGTCTTACCT-3’A2：5’-AGGAGGAAACTGAGGCCCAGAGAAG-3’S2：5’-AGGCTGTAATCAGAGCTGCCGTATG-3’A1：5’-TGGCGGTTCTGAAGGTCGGGATAGT-3’S1：5’-GGACTGGGCATCAGGGTCTCCACT-3’目前六十七页\总数九十一页\编于十点第二轮RACEPCR电泳图谱Fig231stPCRofNestPCRFig242ndPCRofNestPCRM:marker;Control:BlankControl;R+F:Upper+lowerprimer;F:Upperprimer;R:lowerprimerFig23Fig24目前六十八页\总数九十一页\编于十点R6全长的拼接5’3’EST片段第二次RACE片段2778bp第一次RACE片段1500bp543bp4821bp将R6命名为YZ-2基因。目前六十九页\总数九十一页\编于十点小结成功建立了利用5‘RACE技术克隆未知基因序列的策略，成功克隆出YZ-2基因全长，NorthernBlot印迹分析证实了该结果。NorthernBlot印迹分析进一步确认了YZ－2基因在脑缺血中出现上调差异表达。目前七十页\总数九十一页\编于十点YZ-2基因功能的研究生物信息学分析目前七十一页\总数九十一页\编于十点生物信息学分析网站和工具进行基因/蛋白质功能分析的网站和工具：：ProtScale交互式在线电脑分析软件：Swiss-Prot数据库：DNASTAR电脑分析软件目前七十二页\总数九十一页\编于十点生物信息学对YZ-2蛋白一级结构及理化特性的分析YZ-2蛋白一级结构及理化特性：编码氨基酸：244animoacids

理论等电点(pI):9.52

分子量(MW)：29280.0DA

酸性氨基酸残基总数(Asp+Glu):2

碱性氨基酸残基总数(Arg+Lys):7

分子式（Formula）:C801H1203N217O234S6

原子总数（Totalnumberofatoms）:2461

预期半衰期（Estimatedhalf-life）:1hr(invitro)2min(yeast,invivo).2min(Escherichiacoli,invivo)目前七十三页\总数九十一页\编于十点YZ-2基因编码的氨基酸序列RHLPPPVDTGTENRTYQASSAAFRYTAGTPYKVPPTQSNTAPPPYSPSPNPYQTAMYPIRSAYPQQNLYAQGAYYTQPVYAAQPHVIHHTTVVQPNSIPSAIYPAPVAAPRTNGVAMGMVAGTTMAMSAGTLLTTPQHTAIGAHPVSMPTYRAQGTPAYSYVPPHW（244aa）目前七十四页\总数九十一页\编于十点生物信息学对YZ-2抗原性的分析

抗原性分析（Antigenicity）(1)Score1.136length57atresidues54->110（Middle）(2)Score1.136length8atresidues156->163(C-terminal)(3)Score1.101length12atresidues138->149(C-terminal)(4)Score1.070length11atresidues42->52(N-terminal)(5)Score1.056length9atresidues17->25

(N-terminal)

目前七十五页\总数九十一页\编于十点生物信息学同源性分析结果

核酸数据库

1.GeneBank2.EMBL3.DDBJ

蛋白质数据库1.SWISS-PROT2.PDB

3.Prosite

与大鼠脑中的KIAA0280基因高度同源，同源性达96％。蛋白质同源性分析表明:该蛋白质序列为新的蛋白。目前七十六页\总数九十一页\编于十点

小结生物信息学分析结果：首次发现YZ-2为一新的蛋白质。目前七十七页\总数九十一页\编于十点YZ-2基因功能的研究抗体制备及皮层细胞体外缺氧模型的建立目前七十八页\总数九十一页\编于十点免疫多肽的设计与合成

生物信息学对抗原性（Antigenicity）分析预测

Score1.136length8atresidues156->163Score1.101length12atresidues138->149144166

↓

↓

CPVSMPTYRAQGTPAYSYVPPHW

↓

化学合成↓含22aa的多肽（纯度97％）目前七十九页\总数九十一页\编于十点YZ-2多克隆抗体的制备抗体制备的步骤多肽+福氏佐剂乳化家兔皮下多点接种程序化多次注射抗体检测

效价检测(Elisa)特异性检测(Westernblot)目前八十页\总数九十一页\编于十点多克隆抗体制备检测结果Fig30Thevalencassayresultofmulti-cloneantinodyproducedfromrabbitbyman-madesynthezedpolypeptide.抗体效价1:25600目前八十一页\总数九十一页\编于十点WesternBlot

分析图31YZ-2在脑缺血组织中的表达的Western印迹分析Fig31ThewesternblotanalysisofexpressionofYZ-2incerebralischemiaLaneM:marker;Lane1:Ischemiafor0.5hr;Lane2:Control;Lane3:Ischemiafor2hrs;Lane4:Control.Arrowshowthemolecularweight(MW)ofYZ-2DaDa目前八十二页\总数九十一页\编于十点大鼠皮层细胞体外缺氧模型的制备

实验步骤:密闭容器内放入培养7-8d的胎鼠皮层细胞