霉菌的分离纯化和鉴定

霉菌的分离、纯化与鉴定当前第1页\共有43页\编于星期四\13点怎样鉴定微生物呢？微生物鉴定主要是要回答两个问题：

一、它是不是某一种菌？

——针对性；——规范的检测鉴定方法；——如：致病菌检测；

二、它到底是什么菌？——常规鉴定；——大致的工作步骤；——如：筛菌，潜在用途；2当前第2页\共有43页\编于星期四\13点分离资源微生物的基本原则一、微生物可谓无处不在，获得什么样的微生物，取决于分离的目的：特定类群微生物的分离（定向分离）；获取新资源（分离未知菌）；分离“混合菌”（完成某种功能的一组菌）；二、分离的基本原则是：获得目的菌；排除非目的菌；3当前第3页\共有43页\编于星期四\13点总思路流程采样预处理初筛复筛形态学观察生理生化实验分子生物学方法1、微生物资源的分布；2、样品的采集：2h、4℃；1、目的菌的富集培养；2、减少非目的菌；3、目的菌的充分释放；1、培养基设计原则；2、分离方法介绍；3、培养条件；1、获得纯培养；2、选择目的菌株；1、霉菌简介；2、菌落形态；3、霉菌制片观察；18SrRNA1、真菌的系统发育谱；2、微生物快速鉴定技术；4当前第4页\共有43页\编于星期四\13点一、微生物资源的分布及样本的采集土壤环境：每年春季或旱雨季之交，一般在3-5月为佳；通常采集10-40cm深处的土样；若要分离放线菌和真菌，土样应放到无菌牛皮纸袋中，一般不放在瓶子或塑料袋中；如果要分离细菌，最好要保湿；海洋环境及湿地：0.5μm的滤膜过滤水样，以增加出菌率；Ekmann型采泥器或重锤式取样器采集；样品装入无菌瓶内，不能密封，在3h内用于实验；极端环境：尽量存放在与采样环境相当的条件下至菌种分离；植物和动物：确保样品的完整性，迅速对植物切口进行消毒，并用石蜡封住以防外来菌种入侵，用无菌装置带回；如动物粪便的采集应在动物排便后马上收集其中间部分，避免外源污染，置于无菌袋内；5当前第5页\共有43页\编于星期四\13点二、样品的预处理1、目的菌的富集培养根据目的菌的生理特性，加入其所需要的营养物质及微量成分进行诱导增殖，增菌；设计特定的有利于待分离菌株生长的环境。——为了分离铁硫杆菌，可将样品加硫磺后培养；——为了分离分解纤维素或角蛋白等的酶产生菌，可以将样品与

高浓度的纤维素或角蛋白（适当加入其他成分）在适当温度下保湿培养一段时间，再进行分离；2、减少非目的菌

——若目的菌耐干燥，则可通过干燥减少非目的菌；——若要分离高温菌，可在特定高温下震荡培养若干时间，以减少非耐热菌的干扰；——加入非目的菌的抑制剂；3、目的菌的充分释放——使目的菌与样品基质分离：加入活化剂或乳化剂；震荡及超声波处理，DDC技术；酶法或研磨等组织破碎法；6当前第6页\共有43页\编于星期四\13点三、初筛设计选择性培养基，稀释涂布，挑选目标菌株。1、培养基设计原则合适的营养物质及浓度配比，如不同的C/N源；各无机盐比例适当；合适的渗透压或水分活度；适宜的pH等；⑴具体如下：开发意图贯穿分离过程，使培养基“只”满足目的菌的要求，而非目的菌不长；eg.寻找低温碱性脂肪酶产生菌大剂量加入同类化合物；eg.酒精酵母特殊成分；eg.维生素、氨基酸、无机盐等抑制剂：真菌抑制剂：放线菌酮、制霉菌素等；细菌抑制剂：青霉素、链霉素；萘啶酸可抑制革兰氏阴性细菌；放线菌分离中，选用重铬酸钾做抑制剂能很好的抑制细菌和真菌，几乎不影响放线菌的生长；7当前第7页\共有43页\编于星期四\13点⑵常用培养基◆细菌——牛肉膏蛋白胨培养基（肉汤培养基）；

◆放线菌——高氏一号培养基；

◆霉菌——马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查氏酵母膏琼脂培养基(CYA)、麦芽汁琼脂培养基(MEA)、甘油硝酸盐琼脂培养基(G25N)、察氏培养基(CA)、孟加拉红培养基、豆汁培养基、其他；PDA培养基成分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、自来水1000ml、自然PH约6.0察氏培养基成分：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml孟加拉红培养基成分：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100ml、蒸馏水1000ml、氯霉素0.1g上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min

注意事项：①在加入凝固剂之前调pH值；②加酸碱要缓慢，多搅拌；③加热杀菌后pH值下降。8当前第8页\共有43页\编于星期四\13点2、分离方法介绍获得微生物纯培养的几种常用方法(一)固体培养基分离方法1.涂布平板法2.稀释倒平板法3.平板划线法4.稀释摇管法特点：操作简单，是常规方法；缺点：易因涂布不均使某些部位菌落不能分开，不易于计数；注：取样液约；特点：菌落分离均匀，计数相对准确；缺点：操作相对麻烦，热敏感菌易被烫死，严格厌氧菌生长受限；注：取样液约1ml；方法：用接菌环沾取待分离菌或菌液在分离平板上划线分离；特点：简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离；缺点：无法分离得到不可培养的内生细菌；此法最简便，但可能遗落部分菌株；特点：是稀释倒平板法的变通形式；缺点：由于菌落形成在琼脂住中间，观察和挑取困难；应用：在缺乏专业的厌氧设备的情况下对严格厌氧菌进行分离和观察；9当前第9页\共有43页\编于星期四\13点⑵用液体培养基获得纯培养稀释法：方法：接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物；特点：工作量大，是否获得纯培养依靠统计学的推测；应用：用于不能或不易在固体上生长的菌落；10当前第10页\共有43页\编于星期四\13点3、培养条件项目类型温度培养时间细菌37℃1-2d放线菌28℃5-7d霉菌和酵母菌28℃5-7-14d注：根据不同培养基性质等因素，培养条件有所差异，需视情况而定。11当前第11页\共有43页\编于星期四\13点四、复筛

将获得的单菌落接种于复筛培养基，给予一定条件进行培养，对产物产率、性能等相关标准进行评价，即可挑出所需要的菌株；根据目标菌的性质进行设计：分解淀粉分解脂肪透明圈分解纤维素耐高温低温耐酸碱高渗透压产糖产酶效率—发酵

抑菌效果：滤纸片法、牛津杯法12当前第12页\共有43页\编于星期四\13点初筛与复筛的区别：

◆初筛是指从大量的菌落中随机挑取进行摇瓶试验并通过检测得到一些较优菌株；

◆复筛是指将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株；将所得目标菌接入斜面中，4℃进行短期保存。斜面保存13当前第13页\共有43页\编于星期四\13点五、形态学观察1、霉菌简介⑴真菌酵母菌霉菌：蕈xùn菌（大型真菌）丝状真菌的统称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌（除少数外），统称为霉菌。●分布相当广泛。●是各种复杂有机物的主要分解菌。其是数量最大的纤维素、半纤维素和木质素的主要分解菌。●一般情况下，在潮湿的环境下易于生长，特别是偏酸性的基质当中。培养温度28-32℃。14当前第14页\共有43页\编于星期四\13点⑵分类

目前，真菌学仍然是微生物学的薄弱环节，还有待进一步深入研究。在系统学方面，受到公认的分类体系不多。真菌的类群：

接合菌纲：代表种—毛霉、根霉

子囊菌纲：代表种—酵母菌、羊肚菌

担子菌纲：代表种—鹅膏菌、伞菌

卵菌纲：代表种—异水霉属

半知菌纲：代表种—青霉属、曲霉属、假丝酵母

真菌：Smith、Alexopoulos、Ainsworth分类系统15当前第15页\共有43页\编于星期四\13点代表性霉菌：

①毛霉属②根霉属③曲霉属④青霉属⑤脉孢菌属⑥赤霉菌属16当前第16页\共有43页\编于星期四\13点根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成两种类型：无隔膜菌丝：无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核，这是低等真菌所具有的菌丝类型；有隔膜菌丝：有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个细胞组成，每个细胞内有1个或多个细胞核。在隔膜上有1至多个小孔，使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通，这是高等真菌所具有的菌丝类型；霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝构成。许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。菌丝是中空管状结构，直径约2~10µm。

低等真菌特有

高等真菌特有⑶霉菌的形态结构17当前第17页\共有43页\编于星期四\13点生长在固体培养基上的霉菌菌丝可分为三部分：①营养菌丝：深入培养基内，吸收营养物质的菌丝；②气生菌丝：营养菌丝向空中生长的菌丝；③繁殖菌丝：部分气生菌丝发育到一定阶段，分化为繁殖菌丝，产生孢子。18当前第18页\共有43页\编于星期四\13点几种常见的霉菌形态鉴定主要依据

菌名

形态特征

根霉毛霉犁头霉菌丝匍匐枝假根孢子囊柄孢子囊囊轴囊托囊领

絮状乳白色托网状灰褐色棉絮状灰白色无有有无有有菌丝任何处可生从假根处匍匐枝弓背生出

圆形圆形，较大洋梨形，较小

有有有无有有有无有菌名形态特征曲霉青霉无性孢子分生孢子分生孢子分生孢子有无横隔无无顶囊有无足细胞有无19当前第19页\共有43页\编于星期四\13点⑷丝状真菌的生活史

菌丝产生无性孢子进行无性繁殖

同一菌丝体上产生有性繁殖结构形成有性孢子，进行有性繁殖无性孢子、有性孢子及菌丝断片都能发育成新的菌丝和菌丝体厚垣孢子节孢子分生孢子孢囊孢子卵孢子接合孢子子囊孢子20当前第20页\共有43页\编于星期四\13点2、菌落形态液体培养时的特征：

如果是静止培养，霉菌往往在表面上生长，液面上形成菌膜。如果是震荡培养，菌丝有时相互缠绕在一起形成菌丝球，菌丝球可能均匀地悬浮在培养液中或沉于培养液底部。霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈绒毛状、絮状或网状。菌体可沿培养基表面蔓延生长。由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈现红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。霉菌菌落正反面颜色呈现明显差别。21当前第21页\共有43页\编于星期四\13点霉菌在孟加拉红培养基上的典型特征链霉菌

甘油硝酸盐琼脂：气丝微褐色。基丝无色至淡黄色，在大部分所用培养基内无可溶色素；葡糖天冬素琼脂：气丝初白色，后粉褐色。基丝无色至淡褐色；淀粉琼脂：气丝白色至微褐色带微粉色彩。基丝无色至乳脂色带淡褐色彩；苹果酸钙琼脂：气丝白色。基丝无色。营养琼脂：气丝少，白色。基丝乳脂色。霉菌在孟加拉红培养基上典型特征为灰色菌落，有黑色孢子。举例22当前第22页\共有43页\编于星期四\13点斜面接种法斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种；通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面的纯培养物接种到斜面培养基上，称为斜面培养；霉菌的斜面接种：适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。常用点接法，即点接在斜面中部偏下方；接种室避免碰到试管壁，防止污染；超净台酒精灯附近操作，注意灼烧试管口及棉塞；应斜持试管呈45度角，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面，造成污染；23当前第23页\共有43页\编于星期四\13点3、霉菌的制片观察⑴培养方法①插片法③玻璃纸法②搭片法④印片法(1)制平板、接种(2)插片及培养：用无菌镊子取无菌盖玻片，在已接种平板上以45°角斜插入培养基内，插人深度约占盖玻片1/2长度。将插片平板倒置于28℃，培养3～7d；(3)培养后的菌丝体生长在培养基及盖片上。在缺少营养的盖片上菌丝稀疏,且易产生抱子,便于镜检。◆可观察到菌体自然生长状态下的特征，且便于观察不同生长期的形态。(1)开槽及接种：用无菌打孔器在凝固后的平板培养基上打洞数个，并将孢子划线接种至洞内边缘；

(2)搭片及培养：在接种后的洞面上放一无菌盖玻片，平板倒置28℃，培养3～7d；(3)水封片观察：取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将搭片法培养皿中的盖玻片取出，将有菌面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍镜观察，并绘图。(1)玻璃纸前期准备：以无菌操作用镊子将已灭菌的小块玻璃纸片铺在培养基表面，用无菌涂布棒将玻璃纸压平，不留气泡，每个平板可铺5-10块玻璃纸；

(2)涂布菌液及培养：取0.lml孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面，接种平板倒置于28℃，培养5～7d；(3)直接玻璃纸观察：于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上，注意不能有气泡。于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况，再用高倍镜仔细观察。◆用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用此微热载玻片盖在长有待观察菌的平皿上，轻轻压一下；◆注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏菌体的自然形态；◆反转有印痕的载玻片微微加热固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，晾干；◆用油镜观察，并绘图。◆印片法主要用于观察孢子形态、排列及其形状等，方法简便。⑤小室培养24当前第24页\共有43页\编于星期四\13点霉菌的小室培养㈠培养小室准备及灭菌在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在其上面放一个U型玻棒，在U型玻棒上放一块载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖，做八个,留两个空培养皿,包扎后于121℃灭菌30min,烘干备用。㈡

PDA培养基准备在无菌箱中，取已灭菌的马铃薯琼脂培养基注入另两个已灭菌培养皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成1cm~1.2cm×1cm~1.2cm的方形琼脂块，将其移至培养小室的载玻片上，载玻片两端各放置一块。㈢接种无菌操作用接种环挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。㈣培养通过无菌操作，在培养小室中圆滤纸片上加3ml灭菌的20%甘油（用于保持湿度），盖上盖皿，于28℃培养。㈤镜检从培养箱中取出载玻片在低倍镜下观察四种霉菌菌丝体及孢子的形态特征，必要时换高倍镜。*注意事项在载玻片培养观察中，注意无菌操作，接种量要少并尽可能将分散孢子接种在琼脂块边缘，避免培养后菌丝过于密集影响观察。25当前第25页\共有43页\编于星期四\13点2、染色方法制片时染色液是必须的；常用两种：乳酸品红染色和乳酸苯酚棉兰染色；乳酸品红染色液

——百万分之一酸性品红的乳酸溶液；——染色速度快，尤其是幼龄组织上色快；——胞壁组织清晰，适于显微摄影；乳酸苯酚油棉蓝染色液

——10g石炭酸溶于10ml热蒸馏水，再加甘油20ml、乳酸10ml，最后，加棉蓝cottonblue0.22g即成，为油溶性；——折光率好，背景微蓝，细胞不变形，杀菌防腐，且不易干燥，保持时间较长（1896年Amann氏发明）；——菌丝呈蓝色，深度随菌龄增加而减弱；其他：亚甲蓝染色等；26当前第26页\共有43页\编于星期四\13点染色效果附：GB4789.16-2003p2227当前第27页\共有43页\编于星期四\13点六、生理生化实验1、真菌的系统发育有别于系统发育多样化的藻类，除卵菌纲这一较为古老的例外，在真核生物的系统发育树中，真菌是亲缘关系密切的类群。它们之间仅仅在形态特征和有性生活史中呈现出有差异的多样性；真菌的营养要求简单，属于低营养微生物，其代谢和合成不像细菌那样多种多样；因此，目前真菌的分类仍以形态特征和有性生活史作为分类的指征。28当前第28页\共有43页\编于星期四\13点2、微生物快速鉴定和分析技术㈠微量多项试验鉴定系统API20E细菌鉴定系统——鉴定肠杆菌科和部分革兰氏阴性菌29当前第29页\共有43页\编于星期四\13点Enterotube系统该装置可做下列15种试验：葡萄糖产酸产气、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、硫化氢、靛基质、乳糖和卫矛醇发酵、苯丙氨酸脱氨酶、尿素酶和柠檬酸盐、侧金盏花醇、阿拉伯糖、山梨醇和V.P试验等试验。查阅专门设计的结果判定表。30当前第30页\共有43页\编于星期四\13点㈡快速、自动化微生物检测仪器和设备微生物快速检测仪器通用仪器：气相色谱仪、高压液相色谱仪、质谱仪、X射线衍射仪、核磁共振波谱仪、激光拉曼光谱仪及激光显微镜、流式细胞仪等；专用或首先使用的仪器：阻抗测定仪、放射测量仪、微量量热计、生物发光测定仪、药敏测定仪、自动微生物检测仪；31当前第31页\共有43页\编于星期四\13点全自动微生物鉴定系统举例法国梅里埃公司VITEK-32全自动微生物鉴定/药物分析系统美国BDPhoenixTM-100全自动微生物鉴定/药敏检测系统可以同时对100个标本进行鉴定与药敏测试32当前第32页\共有43页\编于星期四\13点鉴定部分：51孔鉴定实验改良经典实验显色＋荧光检测无需附加实验试剂药敏部分：85孔药敏实验比浊＋氧化还原（专利）实测倍比稀释MIC值药物种类与浓度梯度最多耐药机制检测同步进行封闭式设计孔板形状33当前第33页\共有43页\编于星期四\13点重力加样技术主要操作步骤扫描板条，输入资料将检测板放入仪器（随意位置）

34当前第34页\共有43页\编于星期四\13点七、分子生物学手段——18SrRNA大量的实验研究表明：在众多的生物大分子中，最适合于揭示各类生物亲缘关系的是rRNA，尤其是5SrRNA和16SrRNA，而16SrRNA应用更广泛。这是因为：16SrRNA①rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变；②在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；④16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是18SrRNA）；③16SrRNA相对分子质量大小适中，易于提取，便于序列分析；因此它可以作为测量各类生物进化的工具。35当前第35页\共有43页\编于星期四\13点真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔；其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元,三者高度保守,适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析,其间的间隔区为内转录间隔区(ITS),包括ITS1及ITS2两部分,由于进化相对迅速而具多态性,因而适合于等级水平较低的系统学研究。真菌鉴定：工作经验+时间=鉴别困难；rDNA-ITS多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析,可以从核酸序列中获得信息来反映生物亲缘关系与分类情况；真菌序列分析36当前第36页\共有43页\编于星期四\13点主要步骤增菌培养真菌DNA基因组提取核酸浓度与纯度测定——凝胶电泳rDNA-ITS扩增——PCRrDNA-ITS测序与分析将扩增出来的目的核酸片段送专业生物工程公司纯化后进行测序，将测得的序列提交美国NCBI的GENBANK获取对比指标靠前的20个相似序列，通过BLAST工具和DNAMAN软件进行比对分析，并以Neighbor-Joining方法构建系统发育树。37当前第37页\共有43页\编于星期四\13点系统发育树38当前第38页\共有43页\编于星期四\13点八、菌种保藏斜面保藏沙土管保藏斜面每隔3个月至半年需要移植一次；传代次数多，菌种易变异及退化；◆将沙或土过筛﹑烘干﹑装管﹑灭菌﹑然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀﹐放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分﹐干燥後保存或用火焰封管後保存；◆吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态﹐因此可保存较长时期；◆菌种沙土管保藏法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌,可保存2年左右；

39当前第39页\共有43页\编于星期四\13点其他方法矿油封藏法麸皮法液体干燥法或真空干燥法冷冻真空干燥法液态氮超低温冻结法40当前第40页\共有43页\编于星期四