药物定量分析

药物定量分析第一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二第一节

含金属或卤素有机药物

的前处理方法

第二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二一．有机药物中金属或卤素的结合状态二．不经有机破坏的分析方法三．经有机破坏的分析方法第三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二1．含金属的有机药物金属原子不直接与碳原子相连

----结合不牢固有机酸及酚的金属盐或配位化合物。金属原子直接与碳原子以共价键相连

----结合牢固

有机金属药物一．有机药物中金属或卤素的结合状态第四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．含卤素的有机药物卤素和芳环相连：

结合牢固卤素和脂肪链的碳原子相连：

结合不牢固第五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二（一）直接测定法适用于：水溶液中可以电离的药物二．不经有机破坏的分析方法金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物某些C-M键结合不牢固的有机金属药物如富马酸亚铁的含测第六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二直接回流后测定法：适用于卤素原子结合不牢固的含卤素有机药物

三氯叔丁醇的含测/六氯对二甲苯硫酸水解后测定法：

适用于金属原子不直接与碳原子相连的含金属的有机药物。

硬脂酸镁的含测（二）经水解后测定法第七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二1．碱性还原后测定适用于卤素原子和芳环结合的含卤素有机药物。生成的无机卤化物用银量法测定.2．酸性还原后测定同上3．利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量含Sb5+药物，含Fe3+药物（三）经氧化还原后测定法第八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

适用于结合状态牢固的有机金属药物和含卤素有机药物（一）湿法破坏利用强氧化剂将有机金属转变成金属离子。1．硝酸-高氯酸法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏。破坏后的金属离子以高价态存在。对含氮杂环药物的破坏不够完全。三．经有机破坏的分析方法第九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．硝酸-硫酸法适用于大多数有机药物的破坏，但不适用于含碱土金属有机药物的破坏。（生成硫酸盐沉淀）破坏后的金属离子以高价态存在。３．硫酸-硫酸盐法常用于含砷或锑有机药物的破坏，得到低价态的三价砷或锑离子。第十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二（二）干法破坏

----将有机物灼烧灰化适用于湿法不易破坏完全的有机药物及某些不能用硫酸破坏的有机药物不适用于含易挥发金属有机药物的破坏（砷、汞）常加入无水碳酸钠或轻质氧化镁助灰化第十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

-----是一种能将有机化合物中的待测元素定量分解成离子的快速有机破坏方法应注意的有关问题：氧气要充足，确保燃烧完全燃烧产生的烟雾应被完全定量吸收（三）氧瓶燃烧法

oxygenflaskcombustionmethod第十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二样品点燃放入燃烧瓶后，应用手按紧瓶塞（最好用少量水封闭瓶口），直到火焰熄灭，以防燃烧产生的热气将瓶塞顶动；测定氟化物，应用石英燃烧瓶。生成的HF腐蚀玻璃，且与玻璃中的硼生成BF3(BF3在水溶液中仅部分解离成氟离子，使氟的测定结果偏低)；燃烧瓶洗净；防爆。第十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二第十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二第二节

定量分析方法特点第十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二一．容量分析法二．光谱分析法三．色谱分析法第十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二一．容量分析法1．方法：2．关键：

准确地确定等当点3．滴定误差：滴定终点与等当点之间的误差

将已知浓度的滴定液由滴定管加到待测药物的溶液中，直到所加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止，然后根据滴定液的浓度和消耗的体积，就可以计算出被测药物的含量滴定液与被测药物完全作用，反应达到化学计量点即等当点第十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二4．特点：简便，快速，精密、准确专属性、灵敏度较差

常用于测定高含量或中含量组分

1%以上的含量第十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二5．计算问题滴定度T：指每ml某摩尔浓度的滴定液所相当的被测药物的重量

aA+bB⇌cC+dDT=M×(b/a)×B（mg/ml）

M:滴定液的毫摩尔浓度(mmol/ml)；

B:被测药物的毫摩尔质量(mg/mmol)第十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二百分含量计算：直接滴定：含量%=F=滴定液的实际摩尔浓度/滴定液的规定摩尔浓度第二十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二剩余滴定（做空白实验）：先加入定量过量的滴定液A,当与被测药物反应完全后,再用另一滴定液B回滴剩余的滴定液A

含量%=

V0：空白试验消耗滴定液B的体积

VB：样品测定试验消耗滴定液B的体积第二十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二二．光谱分析法1．Lambert-Beer定律ε：摩尔吸收系数：百分吸收系数

ε=×(M/10)（一）UV-Vis分光光度法第二十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．仪器校正和检定波长校正：仪器使用前校正吸收度准确度的检定：用重铬酸钾的硫酸溶液检定杂散光的检查：第二十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二3.对溶剂的要求溶剂在所选波长附近的吸收度应不超过一定值空气为空白第二十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二4．测定法核对:

供试品的实际吸收峰波长是否与药典给出的波长一致(±1nm)

如果不一致，可能与试样的真伪、纯度及仪器波长的准确度有关.第二十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二选择合适的定量方法测定校正曲线法对照法吸收系数法:

仪器应仔细校对、检定计算分光光度法以配制供试品溶液的同批溶剂为空白第二十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二1．特点应在低浓度溶液中进行

高浓度：产生内滤光效应和自吸收现象线性偏离内滤光效应：溶液中存在能吸收激发光和荧光的物质，使荧光强度减少。干扰多，需做空白试验（二）荧光分析法第二十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二校正仪器灵敏度：供试品对激发光稳定：可用样品的对照品溶液校正供试品对激发光不稳定：

采用发射光谱与供试品近似的物质校正蓝色荧光---硫酸奎宁的稀硫酸溶液黄绿色荧光---荧光素钠水溶液红色荧光---罗丹明B水溶液第二十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．含量测定

Cx=×Cs

0.5-2.0

荧光强度与药物浓度成正比关系第二十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二1．HPLC法最常用固定相：

octadecylsilane-bondedsilicagel

十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C18）柱温、检测器：

室温、紫外检测器三.色谱分析法第三十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二药典正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分和检测器类型不得任意改变外，其余条件如色谱柱内经、长度、固定相牌号、流动相流速及各组分比例等可适当改变，以适应具体样品品种及达到系统适用性试验的要求。第三十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

系统适用性试验色谱柱的理论塔板数分离度重复性拖尾因子第三十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二色谱柱的理论塔板数N=5.54(tR/W1/2)2=16(t/W)2

改变柱长、内径、固定相牌号、固定相颗粒粒径等

第三十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二定量峰与其它峰或内标峰之间的分离度R应大于1.5分离度第三十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，其峰面积测量值的RSD不应大于2.0%配制相当于80%，100%，120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其RSD不应大于2.0%重复性第三十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

T=W0.05h/2AW0.05h：0.05峰高处的峰宽

A：峰前沿与色谱峰顶点至基线的垂线之间的距离峰高法定量：T应在0.95-1.05之间拖尾因子第三十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二药物分析中常用的HPLC定量方法：内标法：

内标校正曲线法内标一点法：对照法内标校正因子法外标法：

标准曲线法外标一点法：对照法第三十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．气相色谱法药典正文中各品种项下规定的条件除固定液品种、检测器类型及特殊指定的色谱柱材料不得任意改变外，其余条件如色谱柱内经、长度、载体牌号、载气流速等可适当改变，以适应具体品种及系统适用性试验的要求。第三十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二系统适用性试验：同HPLC定量方法：手动进样：内标法消除较大的进样误差留针时间、气化室高温自动进样：内标法、外标法顶空进样：标准溶液加入法(内加法)

消除基质效应的影响供试品和对照品处于不完全相同的基质中第三十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二标准溶液加入法精密称取待测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定主成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品溶液中主成分含量。第四十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二外标法按下述公式进行计算：加入对照品溶液前、后校正因子应相同，即：Cx和Ax：供试品中组分X的浓度和色谱峰面积；△Cx：所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度；Ais：加入对照品后组分X的色谱峰面积。第四十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二第三节

药品质量标准分析方法

验证第四十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

需验证的分析项目：鉴别试验杂质限度或定量检查原料药或制剂中有效成分的含量测定制剂中其它成分的含量测定溶出度、释放度测定方法第四十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

需验证的内容：准确度精密度专属性检测限定量限线性线性范围耐用性第四十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二一．准确度高、中、低三个浓度，每个浓度3份1．原料药：

用已知纯度的对照品测定。第四十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．制剂：用含已知量被测物（对照品）的各组分混合物进行测定－－回收率若不能得到制剂的全部组分，可向已测定含量的制剂中加入已知量待测物（对照品）进行测定。

－－加样回收率第四十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二1．表示方法

标准偏差SD

相对标准偏差

relativestandarddeviationRSD

即变异系数

coefficientofvariationCV二．精密度第四十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2.重复性在相同条件下，由同一个分析人员测定同一种样品所得结果的精密度。

日内精密度测定高、中、低3个不同浓度的样品，每个浓度测定3-5份样本。或一种浓度的溶液连续测定6次。第四十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二3．中间精密度在同一个实验室、不同时间由不同分析人员用不同仪器测定结果的精密度。常做日间精密度

由于测定持续时间长，往往在同一天内不能完成，故样品测定时使用的仪器性能、试剂、标准曲线及环境条件等都可能发生变化，而使测定结果发生变化。第四十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二４．重现性在不同实验室，由不同分析人员测定结果的精密度。若分析方法作为法定标准，应做第五十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二指样品中有其他成分存在时，分析方法能准确测定出待测药物的特性鉴别、杂质检查和含量测定：均考察专属性对鉴别反应：不含被测药物的样品，应呈负反应三．专属性第五十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二对杂质检查和含量测定：待测成分应能与其它成分分离给出代表性图谱，说明专属性若无杂质和降解产物，可用强光照射、高温、高湿、酸破坏、碱破坏、氧化破坏的方法，产生杂质和降解产物．第五十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二指待测物能被检测出的最低浓度或量。反映：分析方法与仪器的灵敏度、仪器的噪音大小、

样品经处理后空白值的高低。

四．检测限

limitofdetection,LOD第五十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二１．UV-Vis和荧光分光光度法做多次空白试验，求背景响应值的标准偏差SD，则:LOD=3SD有时用校正系数进行校正：UV-Vis：

LOD=f×3SD=（C样

/A样）×3SD荧光分析：

LOD=f×3SD=[C样

/（F样-F空）]×3SD第五十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．色谱法

S/N=2或3时的对应浓度或注入仪器的量第五十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二指待测物能被定量测定的最低浓度或量。能满足一定准确度和精密度的要求S/N=10时，待测物浓度或注入仪器的量五．定量限limitofquantitation,LOQ第五十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二在一定浓度范围内，测试结果与样品中待测物浓度或量直接呈正比关系的程度。UV法：C~A色谱法：C~HorA数据要求：回归方程、相关系数和线性图。至少5个点六．线性第五十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。通常指线性范围七．范围第五十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

当测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。常见变动因素：被测溶液的稳定性；样品提取次数、时间等；HPLC中：流动相组成和pH，色谱柱的厂牌、批号，柱温，流动相流速等；GC中：色谱柱的厂牌、批号，固定相和载体的类型，柱温等。八．耐用性第五十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

验证分析方法的具体内容

鉴别杂质检查含量测定及溶出度测定定量限度准确度－＋－＋重复性精密度中间精密度－－＋＋*－－＋＋*专属性＋＋＋＋检测限－－**＋－定量限－＋－－线性－＋－＋范围－＋－＋耐用性＋＋＋＋*已有重现性验证，则不需**视具体情况予以验证第六十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二第四节

生物样品分析概述

第六十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二一．常用样品的种类、采集和贮藏二．生物样品分析预处理技术三．定量分析方法验证第六十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二常用品种：血液、尿液、唾液其次：可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。（一）生物样品一．常用样品的种类、采集和贮藏第六十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二

1．血样

血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓抗凝自然全血（加抗凝剂）血液第六十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二采样与保存采样：保存：血样（血浆、血清）及时分离→冷藏或-70℃，有时加入稳定剂

稳定剂：酶抑制剂（NaF、三氯醋酸），抗氧剂解冻方法：

第六十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二2．尿样目的：药物剂量回收，药物清除率，药物代谢和生物利用度特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应作水解处理保存：立即测定（尿中含水、无机盐、尿素等）；4℃保存；放置较长时间需冷冻；加入防腐剂（1%甲苯；饱和氯仿）或改变pH第六十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二1、预处理的目的存在形式的多样性：游离、结合物、代谢物浓度低，杂质多出现浑浊和沉淀影响色谱柱寿命二．生物样品分析预处理技术第六十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二药物理化性质：

pKa亲脂性挥发性溶解度稳定性光谱特征与蛋白的结合程度浓度范围：

测定目的：定性定量母体代谢生物样品的种类：样品处理与分析方法的选择

①专一性②灵敏性2、预处理方法选择的一般原则第六十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二3、生物样品中蛋白质的处理（1）目的：去除蛋白质，使结合型药物和代谢物释放出来，便于测定总浓度；预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成；保护仪器性能。第六十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二（2）方法：蛋白质沉淀剂法与水相混溶的有机溶剂：乙腈，甲醇，乙醇，丙酮，THF中性盐：饱和硫酸铵，硫酸钠，磷酸盐，

NaCL，

枸橼酸盐强酸：三氯醋酸，高氯酸，硫酸-钨酸混合液含锌盐和酮盐的沉淀剂：

CuSO4-Na2WO4,ZnSO4-NaOH第七十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二酶解法适用于遇酸不稳定及与蛋白质结合牢固的药物常用蛋白水解酶中的枯草菌溶素（细菌性碱性蛋白分解酶）微孔滤膜法用于测定样品中的游离药物或代谢物与蛋白质结合的药物不能滤过。第七十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二4、生物样品中缀合物的水解（1）目的：使缀合物中的药物或代谢物游离，便于用有机溶剂提取缀合物的极性较大第七十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二（2）方法酸水解法：盐酸酶解法：

β-葡萄糖醛酸苷酶，芳基硫酸酯酶，二者的混合酶；

溶剂解某些药物的硫酸酯，往往加入提取溶剂时发生分解，同时提取到有机溶剂中第七十三页，共九十二页，编辑于2023年，星期二5、生物样品中药物或代谢物的萃取液-液提取提取率在有机相与水相中溶解度的比值；一般少量多次，提取率高对生物样品：样品量少、样品数多、药物含量低，一般一次萃取（至多两次），提取率一般应>50%

第七十四页，共九十二页，编辑于2023年，星期二影响提取率的因素水相pH：碱性药物在碱性pH，酸性药物在酸性pH提取溶剂：相似相溶原理。沸点低，不影响检测，性质稳定，不起化学反应离子强度：加入中性盐，增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取提取次数：提取-反提取第七十五页，共九十二页，编辑于2023年，星期二离子对提取适用于离子性特强，水溶性极大的药物药物含阴离子：-COO--SO3-

离子对试剂：烷基季铵盐药物含阳离子：-NH+

离子对试剂：烷基或芳基磺酸盐

第七十六页，共九十二页，编辑于2023年，星期二乳化问题预防措施：

①轻缓振摇；

②不溶物应过滤掉

③避免在高pH条件下，从水中提取药物

④避免使用易发生乳化的溶剂对：如水-苯，水-己烷

⑤萃取前水相中加入少量NaCl

第七十七页，共九十二页，编辑于2023年，星期二乳化问题破乳方法：

①机械法

②加乙醇或少量高级脂肪醇,改变表面张力

③改善混合溶剂比例，增加分散相的百分数第七十八页，共九十二页，编辑于2023年，星期二液-固提取操作步骤：①固相柱选择：依据样品体积、被测物的量及理化性质②固相柱处理反相C18：固定相的6-10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化；6-10倍缓冲液冲洗达分离状态③上样④分离：用适当的弱溶剂洗涤洗去杂质，通N2干燥固相柱⑤洗脱待测物：改变洗脱剂pH或极性第七十九页，共九十二页，编辑于2023年，星期二影响液-固提取的因素流速

上样流速快：按触不充分，样品流失,回收率低装样：过载样品突破性试验：一系列体积的已知浓度样品液上样，洗脱后，求回收百分率；当回收率下降时为过载。第八十页，共九十二页，编辑于2023年，星期二柱切换HPLC：两个泵，预柱，分析柱固相微萃取SPME：第八十一页，共九十二页，编辑于2023年，星期二第八十二页，共九十二页，编辑于2023年，星期二6、生物样品中待测组分的浓集

避免直接加热浓缩