杂交瘤细胞的培养工艺课件

27抗体药物27.1抗体与抗原的涵义27.2抗体药物的结构特性27.3抗体药物的类型27.4抗体药物的功用27.5典型抗体药物生产技术及工艺姓名：韩亚平27.1抗体与抗原的涵义抗体

(antibody)是能与相应抗原特异性结合的具有特定功能的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，它是在抗原的刺激下，淋巴细胞增殖和分化之后分泌出来的免疫球蛋白。抗体还可解释为：能与相应抗原(表位)特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。在人和动物体内，由于抗原或半抗原入侵刺激机体而在细胞中产生的免疫球蛋白。能可逆、非共价、特异地与相应抗原结合，形成抗原-抗体复合体。机体内B细胞在抗原刺激下所产生的具特异性免疫功能的球蛋白。具有抗原结合部位，能与抗原分子上相应表位发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。抗体可通过三种方式中和、除去有害物质：（1）直接使抗原失活；（2）使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏；（3）抗原表面弱化，从而易受补体破坏。它与免疫球蛋白的区别在于，抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性功能。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应，因而常给抗体以不同的名称，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等。抗体的组成抗体的组成极为复杂，是由成千上万、多种多样的免疫球蛋白(Ig)分子所组成。这些Ig分子在形状、大小、结构以及氨基酸的组成和排列上，既相似，又有差别。由于有差别，它们的电泳活性就有很大的变化。因为抗体具有与抗原决定簇相对应的结合部位（抗原结合簇），所以抗体与抗原的结合具有特异性。另一方面，抗体本身是一种蛋白质，具有本身的氨基酸组成、排列和立体结构，对异种动物来说，它又是抗原。Ig抗原的特异性各类Ig都具有可用血清学方法检出的抗原特异性，它们表现出不同的血清学类型。Ig抗原的特异性有3种:①同种型特异性：同一种属所有个体共同具有的抗原特异性。人的Ig可分为5大类(IgM、IgG、IgA、IgD、IgE)、两个型(λ型和κ型)、以及若干亚类、亚型、群和亚群等。但是，抗体和抗原结合的特异性与抗体的类、亚类、型别等无关；②同种异型特异性：同一种属（如人）的某些个体共有的抗原决定簇。这是由遗传基因决定的，某些重链和轻链(κ)的恒定区内，有个别氨基酸发生置换而形成Gm、Am、Km各型；③独特型特异性:由单一B细胞克隆产生的Ig分子独有的抗原性。此决定簇在重链和轻链的可变区，特别是在可变区的超变区中。由于每一个体抗体形成细胞是由多克隆组成，所以独特型特异性为数极多。

任何一个正常人血清中的抗体都是含有成千上万的、多种多样的、具有各种独特型抗原性的免疫球蛋白分子混合物。κ链和λ链可以和各类、各亚类配合。重链、轻链本身又有各种异型，每一克隆产生的Ig又具有自身的独特型。抗体的多样性受B细胞系统的遗传基因控制。肽链是由两个不同基因分别编码可变区或恒定区，恒定区的基因（C基因）是有限的,它虽然可以决定Ig分子的类别和亚类，为造成Ig分子多样性的原因之一，但是，造成免疫球蛋白分子多样性的主要原因却在于可变区的异质性，可变区是由V基因编码的，而V基因的数目仍不清楚。抗原（antigen）是能与抗体结合的物质，可分为蛋白抗原和非蛋白抗原。对于蛋白抗原，在缺乏T淋巴细胞时，不能引起抗体产生反应，称为T细胞依赖性抗原。非蛋白抗原在无T细胞时，也能产生抗体，如多糖、脂类及核酸等，也称为非T细胞依赖性抗原。蛋白抗原与B淋巴细胞表面的受体结合后，通过内化加工，形成小肽与MHCⅡ类分子形成复合物，向T细胞提呈，T细胞通过膜相关的分子接触识别及分泌多种淋巴因子，刺激B细胞增殖和分化，并分泌抗体。B淋巴细胞来源于骨髓干细胞，并在骨髓中成熟，是抗体的生成细胞。在前B淋巴细胞阶段，胞浆中合成μ链，在非成熟B淋巴细胞阶段合成κ和λ轻链，与μ链组装形成IgM，表达于细胞表面，形成特异的抗原受体，并与Igα和Igβ形成复合物。在成熟B淋巴细胞阶段，表达IgM和IgD，μ链和δ链具有相同V区。成熟B淋巴细胞离开骨髓，进入血液循环和周围淋巴组织。抗原经血或淋巴进入周围淋巴组织，与成熟的B淋巴细胞相遇，B淋巴细胞表达lgM和IgD，可作为特异抗原的受体。抗原和膜型IgM和IgD结合，立即启动B淋巴细胞的活化，使其增殖并分化成为具有典型形态特征的细胞即浆细胞，分泌型Ig增多，膜型Ig减少，最终分泌抗体。每一个B淋巴细胞仅表达对其某一个抗原决定簇专一的Ig具有等位基因排斥和轻链同种型排斥性。抗原分子中与抗体结合的部位为抗原决定簇(determinant)或表位(epitope)，蛋白性抗原有多个决定簇，互不相同，为非多价抗原。而多糖、核酸具有多个相同决定簇，为多价抗原。蛋白性抗原的决定簇可分为线性决定簇和构象决定簇两种，线性决定簇由相邻的氨基酸残基构成，一般包括6个氨基酸残基。而构象决定簇由空间相互靠近的氨基酸残基组成。抗原与抗体的反应抗原与抗体可发生高度专一性的反应。抗原与抗体的反应是抗体的V区互补决定区形成的三维构象与抗原高级结构表面的决定簇之间的反应，为非共价键结合，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用力等。抗原抗体反应具有高度特异性，但也可能与多种抗原发生交叉反应。抗原与B细胞膜Ig受体结合后，可促使抗体V区发生突变，通过选择增加亲和力，即亲和力成熟。抗体由膜型转变为分泌型时，C区发生类别转换，便于抗体行使功能。血清免疫球蛋白具有高度异质性和抗体的多样性(diversity)。抗原与抗体的反应抗原与抗体的反应每种B淋巴细胞只能按其固有的遗传信息接受一种抗原决定簇或表位的刺激，大量增殖形成一个具有相同遗传特性的克隆细胞群，产生一种化学结构完全相同，在结构上与抗原决定簇互补的特异抗体——即单克隆抗体。因此，进入机体的每一种抗原能被针对其不同抗原决定簇的各种抗体所识别，而每一种抗原决定簇又可由1000～8000种不同的抗体所识别。这就使免疫动物出现极不均一的多样性的抗体。不同种系动物产生抗体混合物不同，不同个体对同一抗原决定簇的反应也不同，甚至在不同时间的反应也不尽相同。用抗原免疫动物后获得的常规血清，实际上是由多种多样的单克隆抗体混合而成的多克隆抗体。27.2抗体药物的结构特性抗体药物分子具有功能和结构的双重性，为了识别不同抗原，需要数量巨大的结构多样性；但在发挥体内效应时，需要结构的稳定性。虽然抗体分子是体内最复杂的分子，但具有相似的基本结构，其单体是由2条相同的重链（heavychain，H链）和2条相同的轻链(lightchain，L链）组成的四聚体（图27-1）。图27-1抗体的通用分子结构及其片段特性每条链分为两个区，可变区（variableregion，V区）和恒定区(constantregion，C区）。V区从多肽的N端起，包括轻链的1/2和重链的1/4，其氨基酸的序列变化较大，随抗体的特异性不同而不同。其中高可变区（hypervariableregion,HV区）或互补决定区(complementarydeterminingregion，CDR)是抗原特异结合部位。C区从多肽的C端起，包括轻链的1/2和重链的3/4，同类抗体这部分氨基酸序列变化不大。重链约由450个氨基酸残基(lgG、IgA、IgD)或570个氨基酸残基(lgM、IgE)组成，分子量50~75kd，重链糖基化。轻链由214个氨基酸残基组成，分子量25kd，轻链无糖基化。抗体对称结构，轻重链之间和重链之间以二硫键连接，形成“Y”字形结构。有些抗体由多个单体连接起来形成多聚体，如IgM为5聚体，IgA为2聚体。根据V区抗原性的不同，重链分为γ、α、μ、δ、ε五种，对应的抗体是IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，它们的理化和免疫特性互不相同（表27-1）。轻链有两类κ和λ。表27-1人的各种免疫球蛋白的特性特征IgGIgMIgAIgEIgD重链及亚类γ1γ2γ3γ4Mα1α2εδ多聚体无5聚体2或多聚体无无其它成分无JJ,分泌小体无无重链恒定区数目34343铰链区有无有无有糖含量%3107139血清中的含量/(mg/mL)8~160.7~1.81.6~2.60.00030.04半衰期/d235.15.833分子量/103150（195）5（160）n19018027.3抗体药物的类型根据抗体的生产技术，可把抗体药物分为以下类型。（1）多克隆抗体第一代抗体为多克隆抗体(polyclonalantibody)，也称为常规抗体(conventionalantibody)，是天然抗原经各种途径免疫动物，抽取免疫血清，分离提取制备的抗体，是多种抗体的混合物。1890年Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素(DiphtheriaAntitoxin)，并建立了血清治疗法，开始了第一代抗体药物，如破伤风抗毒素血清，仍然在使用。由于多克隆抗体的不均一，在使用中经常发生非特异性交叉反应而导致假阳性结果，临床应用受到限制。目前，仍然有很多分子生物学和生物化学免疫检测试剂是多克隆抗体。（2）单克隆抗体第二代抗体为单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)，是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一抗体。1975年Kohler和Milstein把来自脾脏能产生抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，进行原生质体融合，得到杂交瘤细胞，通过离体培养就能产生单一抗体。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少的优点，而且来源稳定，可大量生产，应用于临床的抗肿瘤、抗感染、解毒、抗器官移植排斥反应等。第二代抗体主要形式有两种，全抗体和酶解片段抗体。如木瓜蛋白酶水解片段、胃蛋白酶水解片段等。木瓜蛋白酶在铰链区(hingeregion)水解全抗体，产生2个Fab(fragmentwithantigenbinding，为抗体的两臂）和1个Fc(fragmentofcristallization)，胃蛋白酶水解全抗体产生F(ab)2。20世纪70年代建立了杂交瘤(hybridoma)生产单克隆抗体技术。B细胞和骨髓瘤细胞来源于鼠，一般也用鼠生产，所以称为鼠源单克隆抗体。大量的分子生物学和生物化学免疫检测试剂是单克隆抗体。其缺点是有鼠源性，对人体有较强的免疫原性(immunogenicity)；半衰期短，靶向吸收差，全抗体分子量大，很难通过血管进入细胞，特别是肿瘤等部位含量低。（3）人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体以及下面几种抗体都是属于第三代的基因工程抗体，它们是用基因工程方法对鼠源全抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在原核微生物、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达，获得的抗体。包括鼠源抗体的人源化(humanozedantibody)、人鼠嵌合抗体(chimericantibody)、改型抗体(reshapingantibody)、完全人源抗体和小分子抗体（minimalantibody)等。在20世纪80年代中期开始了基因工程人源化抗体的研究，产生了在基因水平对抗体结构进行改造的学科即抗体工程。20世纪90年代开始用抗体库技术、核糖体展示库技术筛选小分子抗体，并用原核细胞表达抗体。抗体与其它蛋白融合，可形成多种具有生物活性的融合抗体。人鼠嵌合抗体(chimericantibody)是由鼠抗体的可变区和人抗体的稳定区组成的抗体。主要是针对鼠源性而进行的基因改造，降低免疫原性，保持或提高亲和力和特异性是改造抗体的两个基本原则。由于恒定区与抗原结合无关，但又是抗体免疫性的主要部位，所以用人恒定区取代鼠恒定区进行人源化，消除大部分异源，保留鼠源的抗原结合的特异性和亲和力。人鼠嵌合抗体是最早研究出来的，已批准应用于临床治疗。实现人鼠嵌合抗体的过程是可变区基因的克隆、表达载体的构建、嵌合抗体的表达。单元操作要点如下：①可变区基因的克隆。可采用RT-PCR，用杂交瘤细胞mRNA为模板，反转录克隆得到可变区基因。也可以从基因组文库中克隆。引物设计是克隆的关键，用第一骨架区序列或前导序列作为5’端引物，以J或恒定区序列的互补序列为3’端引物，根据保守序列进行设计。②表达载体的构建。选择高效载体，将轻链和重链分别构建成相应的表达盒，连接到同一个载体中(图27-2)。图27-2嵌合抗体的哺乳动物细胞表达载体③嵌合抗体的表达。将人鼠嵌合抗体的表达载体共转染宿主细胞，在哺乳动物细胞系如CHO和骨髓瘤细胞SP2/0中，按照动物细胞培养工艺进行生产制备嵌合抗体。

人鼠嵌合抗体仍保留30%左右的鼠源序列，并没有完全消除免疫原性的发生并具有全抗体的缺点。（4）改型抗体改型抗体(reshapingantibody)是把鼠单克隆抗体的CDR移植到人单克隆抗体的骨架区，使人单克隆抗体获得同鼠单抗一样的抗原特异性，因此也称为CDR移植抗体(CDRgraftingantibody)。可变区序列的CDR设计与克隆是改型抗体的关键，合理保留CDR两侧的骨架区序列，可将N端数个氨基酸与CDR一起移植。根据晶体结构和计算机辅助分析，合理设计基于同源性分析和分子结构模型。改型抗体构建的基本思路和流程如下：

①可变区序列的分析。比较鼠与人单克隆抗体的可变区基因序列，包括CDR和骨架区(frameregion，FR)的位置，可变区亚类、亚型的序列，VL/VH界面残基，FR的特殊残基，确定保守性残基和同源性最高的残基，设计改型人可变区基因。②抗体基因序列的克隆。将鼠CDR与人FR连接组合起来，对重要的不同残基仔细分析认定，确定适合人轻链和重链可变区改型残基序列。根据中心法则，将氨基酸序列转换为核酸序列，以最接近的CDR序列为模板，采用重叠PCR突变扩增，获得整个基因序列。③构建人可变区和恒定区基因表达载体，进行生产。将基因构建在载体上，转染后，进行细胞培养表达，分离纯化，得到人改型抗体。人改型抗体比嵌合抗体构建难度更大，已有批准上市的治疗性人改型抗体。但这种抗体仍然不能避免独特型抗体和抗Fc同种特异型抗体产生的可能性。（5）人源抗体人—人杂交瘤融合率低、不稳定，用传统杂交瘤技术制备高亲和力的稳定的人抗体克隆十分困难。但可以用噬菌体抗体库技术、基因敲除技术、置换技术、制备完整全人源抗体片段及全抗体。（6）小分子抗体小分子抗体是分子量较小的具有抗原结合功能的抗体片段。根据抗体的各个结构域功能进行构建，可分为Fab抗体、单链抗体、单域抗体和超变区抗体。小分子抗体具有以下优点：可以在大肠杆菌等细胞中表达，生产成本低；容易穿透血管壁或组织屏障，进入病灶部位，有利于治疗肿瘤等；不含有Fc片段，不与Fc受体结合；有利于进一步进行基因工程改造。小分子抗体的构建可采用常规基因工程的方法和程序，从杂交瘤细胞中分离RNA，纯化mRNA、RT-PCR，克隆相应片段的基因，连接并构建在载体上，在宿主细胞中表达。不同抗体分子的特性见表27-2。表27-2不同抗体分子的特性抗体分子分子量/103体内清除率肿瘤穿透能力肿瘤摄取率IgG155++++++F(ab)2100+++++++diaboby50++++++++ScFv25+++++++++1）Fab抗体

Fab由重链Fd（可变区VH和CH1）和完整轻链（VL和CL）组成，通过二硫键连接形成异二聚体，其大小只有完整全抗体分子的1/3，仅有一个抗原结合位点。Fab的制备有多条途径。第一条途径是用木瓜蛋白酶水解全抗体后，分离纯化制备Fab。第二条途径是基因工程大肠杆菌表达。Fab抗体可在信号肽的引导下分泌进入细菌的周质，前导肽被蛋白酶切除，生成有功能的Fab抗体。第三条途径是对Fab进行改造，制备重组Fab抗体。其恒定区为人源性，H链的V区和CH1功能区的cDNA与L链完整的cDNA重组，表达产物为重组Fab抗体。

2）Fv与ScFv抗体

Fv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能抗体片段，由轻链可变区重链可变区组成，以非共价键结合。可用前导肽引导在基因工程细菌中表达Fv的两个片段分泌进入周质，组装成Fv。由于是非共价键结合，不稳定，所以应用最多的是单链抗体。

单链抗体(singlechainFv，ScFv)是H链V区cDNA3’端与L链V区cDNA5’端，用寡核苷酸接头连接，构成单链可变区基因片段，表达出具有抗原结合能力的抗体，其大小只有全抗体的1/6。Hv和Lv的取向(Hv-Lv，Lv-Hv)不影响抗体的功能，但接头设计很重要，长度不短于3.5nm，至少10个氨基酸残基，具有亲水性，容易折叠，侧链不宜太多，以减少抗原性。接头大多含有14～15个氨基酸残基，但25个氨基酸残基也有活性。最广泛使用的接头是重复4个甘氨酸和一个丝氨酸(GGGGS)3。甘氨酸侧链最短，丝氨酸亲水性最强。ScFv可在大肠杆菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞系统中表达，最常用大肠杆菌。

ScFv在37℃时稳定性较差，可在双链之间增加1个二硫键，提高稳定性，这就是dsFv(disulfide-stabilizedFv)。引入二硫键的位置是此抗体构建的关键，在CDR引入二硫键要严密设计，在远离CDR的骨架区设计具有通用性，如H44/L100或H105/L43引入半胱氨酸。3）单域抗体

单域抗体(singledomainantibody)只含有VH或VL一个功能结构域，大小只有全抗体的1/12，也叫小抗体(minibody)。生产制备相对简单，在大肠杆菌中能表达出活性。超可变区多肽（hypervariableregionpeptide）或最小识别单位（minimalrecognitionunit），只含有一个CDR的多肽，特别是H链CDR3，只有16～30个氨基酸残基，穿透能力强，具有结合抗原的能力，但不完全和不稳定，非特异性吸附明显增加。4）双分子抗体

将两个不同特征的单链抗体分子的VH和VL交叉组合，构建两个杂合的单链抗体，重组在一个表达载体中，则可在大肠杆菌中表达出双特异性双链抗体(diabody)，如F(ab')2。为了增加稳定性，在抗体的C端设计半胱氨酸，形成链间二硫键。缩短接头（1~5个氨基酸），还可形成三链(triabody)、四链抗体(tetrabody)。抗体的C端连接自聚化结构域，使抗体片段多聚化。常用的自聚化结构域有亮氨酸拉链、α螺旋束、CH3、链亲和素等，在抗体与自聚化结构域之间设计一个柔性接头，如GGGGS或IgG3的铰链区，自聚化尾部接半胱氨酸，增加稳定性。（7）融合抗体融合抗体是抗体与其它蛋白融合表达的产物，结合了抗体和其它蛋白的双重功能，形成新的生物活性。利用抗体的同源性识别功能将靶蛋白引导至特定部位，起靶向治疗作用。

1）免疫毒素

免疫毒素（immunotoxin）是抗体与毒性蛋白融合，定向杀伤肿瘤。所用抗体部分为ScFv、dsFv、Fab、diabody等，毒性蛋白有铜绿假单胞菌外毒素、白喉毒素、蓖麻毒素等。免疫毒素只能用大肠杆菌制备，不能在真核细胞中表达。抗体片段与细胞因子融合构成免疫细胞因子(immunocytocine)，也是靶向治疗的手段，所用细胞因子包括IL-2、TNF、IFN、IL-12等。抗体与特异靶向分子融合构成免疫桥连，可结合不同细胞。如抗CD3的抗体与EGF的融合蛋白，可把表达CD3的T细胞与有EGF受体的肿瘤细胞连接起来，介导T细胞杀伤效应。

2）抗体酶

抗体能与抗原特异结合，但不具催化活性；酶与底物的结合也具有特异性，但不具抗体活性。利用基因工程技术，可以设计制备出既具催化活性又具抗体功能的蛋白质分子，即催化抗体(catalyticantibody)或抗体酶(abzyme)。其构建是把与金属离子结合的氨基酸序列插入L链的V区，再与H链V区重组。H链V区识别抗原并选择性结合底物，L链V区促进底物过渡态的形成，发挥催化反应的功能。这样重组抗体的高效催化性和位点结合的特异性为疾病治疗提供了新途径。抗体—酶偶联物(antibodyenzymeconjugate)多采用化学交联方法制备，由此衍生出了抗体靶向的酶前药治疗，很多药物可用于此系统，如包括抗生素、生物碱等，成功的例子有抗Her2的Fv与内酰胺酶融合蛋白，可水解前药头孢菌素。抗体药物还常按下列项目进行分类：(1)按作用对象，可将其分为抗毒素、抗菌抗体、抗病毒抗体和亲细胞抗体(能与细胞结合的免疫球蛋白，如1型变态反应中的lgE反应素抗体，能吸附在靶细胞膜上)。(2)按理化性质和生物学功能，可将其分为IgG、IgA、IgM、IgE、IgD五类。IgM抗体：是免疫应答中首先分泌的抗体。它们在与抗原结合后启动补体的级联反应。它们还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬；IgG抗体：激活补体，中和多种毒素。IgG持续的时间长，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。他们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿得到保护；IgA抗体：进入身体的黏膜表面，包括呼吸、消化、生殖等管道的黏膜，中和感染因子。还可以通过母乳的初乳把这种抗体输送到新生儿的消化道黏膜中，是在母乳中含量最多，最为重要的一类抗体；IgE抗体：的尾部与嗜碱细胞、肥大细胞的细胞膜结合。当抗体与抗原结合后，嗜碱细胞与肥大细胞释放组织胺一类物质促发炎症的发展。这也是引发速发型过敏发应的抗体；IgD抗体的作用还不太清楚。它们主要出现在成熟的B淋巴细胞表面上，可能与B细胞的分化有关。(IgD于1995年从人骨髓瘤蛋白中发现，分子量为175kD，主要由扁桃体、脾等处浆细胞产生，人血清中IgD浓度为3～40μg/ml,不到血清总Ig的1%，在个体发育中合成较晚。IgD铰链区很长，且对蛋白酶水解敏感，因此IgD半衰期很短，仅2.8天。血清中IgD确切的免疫功能尚不清楚。在B细胞分化到成熟B细胞阶段，除了表达SmIgD，抗原刺激后表现为免疫耐受。成熟B细胞活化后或者活化后或者变成记忆B细胞时，SmIgD逐渐消失。)(3)按与抗原结合后是否出现可见反应，可将其分为：在介质参与下出现可见结合反应的完全抗体，即通常所说的抗体，以及不出现可见反应，但能阻抑抗原与其相应的完全抗体结合的不完全抗体。(4)按抗体的来源，可将其分为天然抗体和免疫抗体。(5)根据抗原抗体反应的各种表现形式将抗体分为：①沉淀素指与抗原结合后可发生沉淀反应的抗体；②凝集素是指与颗粒性抗原结合出现凝集的抗体；③溶解素为与细胞膜上抗原结合后，在补体的参与下可使细胞出现溶解的抗体，如溶菌素，溶血素等；④补体结合抗体指与抗原结合后可激活补体的抗体；⑤调理素指具有调理作用,与微生物结合后能促进吞噬细胞吞噬作用的抗体；⑥中和抗体为与病毒结合后,可使病毒失去感染性的抗体。27.4抗体药物的功用最初有人用电泳证明血清中抗体活性在γ球蛋白部分，故曾把抗体统称为丙种(γ)球蛋白。后来发现，抗体并不都在γ区；并且位于γ区的球蛋白，也不一定都具有抗体活性。1964年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig)，如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血症、冷球蛋白血症等患者血清中存在的异常免疫球蛋白以及正常人天然存在的免疫球蛋白亚单位等。因而免疫球蛋白是结构化学的概念，而抗体是生物学功能的概念。可以说，几乎所有抗体都是免疫球蛋白（极少数抗体为RNA），但并非所有免疫球蛋白都是抗体。抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，中和它们所释放的毒素或清除某些自身抗原，使机体保持正常平衡，但有时也会对机体造成病理性损害，如抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗甲状腺球蛋白抗体等一些自身抗体的产生，对人体可造成危害。抗体作用的规律是：(1)初次反应产生抗体：当抗原第一次进入机体时，需经一定的潜伏期才能产生抗体，且抗体产生的量也不多，在体内维持的时间也较短。(2)再次反应产生抗体：当相同抗原第二次进入机体后，开始时，由于原有抗体中的一部分与再次进入的抗原结合，可使原有抗体量略为降低。随后，抗体效价迅速大量增加，可比初次反应产生的多几倍到几十倍，在体内留存的时间亦较长。(3)回忆反应产生抗体：由抗原刺激机体产生的抗体，经过一定时间后可逐渐消失。此时若再次接触抗原，可使已消失的抗体快速上升。如再次刺激机体的抗原与初次相同，则称为特异性回忆反应；若与初次反应不同，则称为非特异性回忆反应。非特异性回忆反应引起的抗体的上升是暂时性的，短时间内即很快下降。抗体药物的生物学功能主要有：(1)特异性结合抗原：抗体本身不能直接溶解或杀伤带有特异抗原的靶细胞，通常需要补体或吞噬细胞等共同发挥效应以清除病原微生物或导致病理损伤。然而，抗体可通过与病毒或毒素的特异性结合，直接发挥中和病毒的作用。(2)激活补体：IgM、IgG1、IgG2和IgG3可通过经典途径激活补体，凝聚的IgA、IgG4和IgE可通过替代途径激活补体。(3)结合细胞：不同类别的免疫球蛋白，可结合不同种的细胞，产生不同的免疫反应，参与免疫应答。(4)可通过胎盘及粘膜：免疫球蛋白G(IgG)能通过胎盘进入胎儿血流中，使胎儿形成自然被动免疫。免疫球蛋白A(IgA)可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。

(5)具有抗原性：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。(6)抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同：不耐热，60～70℃即被破坏。各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作用。抗体可被中性盐类沉淀。在生产上常可用硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中沉淀出含有抗体的球蛋白，再经透析法将其纯化。(7)通过与细胞Fc受体结合发挥多种生物效应。①调理作用IgG、IgM的Fc段与吞噬细胞表面的FcγR、FcμR结合，增强其吞噬能力，通常将抗体促进吞噬细胞吞噬功能的作用称为抗体的调理作用(opsonization)。②发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。27.5典型抗体药物生产技术及工艺下面以鼠源单克隆抗体的制备为例来介绍抗体药物的生产技术及工艺。鼠源单克隆抗体是用动物鼠来生产的，先制备鼠杂交瘤细胞系，然后在体内或体外培养生产抗体（图27-3）。杂交瘤细胞系的制备工艺包括免疫动物、亲本细胞的制备、细胞融合、培养筛选与鉴定、克隆化等过程。图27-3单克隆抗体的制备过程免疫的B淋巴细胞分化为浆细胞，它是产生特异性抗体的细胞，但浆细胞还不能在体外培养基中成功生长，因而不能成为体外生产抗体的来源。骨髓瘤细胞(myelomacell)虽然能在培养基中生长且比正常细胞生长繁殖速度快，但不能产生抗体。将这两种不同功能细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，既具有体外长期迅速增殖的能力，又能持续产生和分泌特定单一成分的特异性抗体。（1）制备亲本细胞①淋巴细胞用特异抗原，按照免疫程序，对纯系健康8周龄的BALB/c小白鼠进行免疫，分离B淋巴细胞。用RPMI-1640或DMEM培养液洗涤脾脏后，将淋巴细胞轻轻挤压到培养液中，细胞计数，置于冰箱备用。一般每只小鼠收集到108个细胞，大鼠2×108个细胞。②骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞应该在完全培养基中生长良好。有遗传标记，丧失了嘌呤或嘧啶核苷酸合成的补救途径，是核酸代谢旁路酶缺陷型，如次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型(hypoxanthineguaninephosphoribosyl

transferase，HGPRT-)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（thymidine

kinase，KT-）。常用的小鼠骨髓瘤细胞系有X63Ag8·653，SP2/O-Ag14，F0，NSI-Ag4-1。两类亲本细胞的动物种系要一致或近源，才能使杂交瘤在同种异体内生长。远源杂交瘤胞系不稳定，分泌抗体能力也很差。1、杂交瘤细胞系的建立（2）原生质体融合采用PEG1000～4000为细胞融合诱导剂。取生长旺盛、形态良好、处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞悬液与新鲜制备的BALB/c淋巴细胞悬液，在离心管中以1：2～10的比例混合，1000r/min离心10min，弃上清。轻轻弹击管壁，使细胞松动，置于37℃水浴中。摇动离心管，在1min内逐滴加入1mL50%PEG（pH7.2-7.4），继续摇动1~2min。在30s内沿管壁加入10mLDMEM或RPMI-1640培养液，不能冲散细胞，转动离心管，使PEG稀释，终止其诱导作用。1000r/min离心10min，弃上清。分配到加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，在HAT培养基中进行选择培养。（3）杂交瘤筛选与克隆化在两类细胞的融合混合物中存在五种细胞，未融合的单核亲本细胞、同型融合多核细胞、异型融合的双核和多核杂交瘤细胞。筛选的目标是获得异型融合的双核杂交瘤细胞。未融合的淋巴细胞在培养过程6～10d会自行死亡，异型融合的多核细胞由于其核分裂不正常，在培养过程中也会死亡，对杂交瘤细胞影响不大。但未融合的骨髓瘤细胞因其生长快而不利于杂交瘤细胞生长和分离。因此要对亲本细胞、培养基等进行选择和处理，设计合理特异性的选择系统，获得目标杂交瘤细胞系。为了除去未融合的骨髓瘤细胞，在培养基中加入次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基蝶呤(aminopterin，A)及胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）进行缺陷筛选。正常细胞的DNA合成有两条途径，主路和旁路。主路途径为全合成途径，利用糖和氨基酸合成嘌呤和嘧啶，生物合成途径需要叶酸作为氢的来源。氨基蝶呤抑制了从二氢叶酸到四氢叶酸的合成，从而阻断主路DNA的合成。由于未融合的骨髓瘤细胞是HGPRT—或KT—，因此只有主路DNA合成途径的未融合的骨髓瘤细胞，被氨基蝶呤阻断后，无法合成DNA而死亡。B淋巴细胞具有旁路合成途径，通过HGPRT酶和TK酶，即可利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷来合成DNA。杂交瘤细胞由于有B淋巴细胞的遗传物质，HGPRT+将次黄嘌呤转换成嘌呤，TK+将胸腺嘧啶核苷转换成胸腺嘧啶，可以通过旁路补救途径合成DNA，得以生存。在HAT培养基中，淋巴细胞及其自身融合体，虽有HGPRT酶，却不能长期生长，一般在2周内自然死亡。这样，只有真正的融合的杂交瘤细胞才能正常生长，被筛选分离出来。将细胞悬浮在HAT培养液（20%胎牛血清，10mmol/LHEPES，10μmol/L巯基乙醇，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，0.25μmol/L抗真菌素Fungizone，加入DMEM或RPMI-1640中制成D-15培养液，再加入100μmol/L次黄嘌呤，0.4mol/L氨基蝶呤，100μmol/L胸腺嘧啶核苷）中，细胞浓度为2×106个/mL。在96孔培养板中，每孔加入0.1mL细胞悬浮液，或在24孔板上每孔加入1mL细胞悬浮液。如果必要，在小孔中预先加入饲养细胞，促进融合细胞的生长。同时设置对照实验。加盖并密封培养板边沿后，在5%CO2培养箱中37℃培养。次日检查是否污染，如果无污染，吸出一半培养液，补充等体积的HAT培养液，以后隔日换液一次。两周后改用HT培养液，以消耗氨基蝶呤，换液3~5次，集落直径1~2mm后，改用D-15培养液，进行保存。一般5～6d后新的融合细胞克隆出现，未融