2023学年完整公开课版蛋白质

生物化学课件(供农学类专业使用)2011，3蛋白质化学第三章一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。概述二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递2.蛋白质具有重要的生物学功能3.氧化供能蛋白质的分子组成

TheMolecularComponentofProtein第一节一、组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘

。

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。

蛋白质元素组成的特点由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%二、蛋白质的基本单位-氨基酸

(一)氨基酸的结构(通式)存在自然界中的氨基酸有200余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种(20-22)，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）如图示。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式RCH

COOH

RR:H甘AA;R:CH3丙AAR:CH-OH苏AACH3H2N非极性側链氨基酸非电离极性側链氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸(二）氨基酸的分类*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98

异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性側链氨基酸目录色氨酸

tryptophanTrpW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTyrY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.非电离极性側链氨基酸目录天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸目录几种特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH（三）氨基酸的重要理化性质

1、一般物理性质无色晶体，熔点极高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。2、两性解离和等电点氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子，为两性电解质。3.化学性质（1）与茚三酮的反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几μg）。调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶体状态或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在碱性溶液中的氨基酸（pH＞pI）（当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的α-氨基，α-羧基是可以离子化的。氨基酸等电点的确定：1）酸碱滴定（滴定曲线）2）根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK32（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2氨基酸在溶液中主要以偶极离子形式存在，其氨基与羧基相距很近。受氨基的影响，用碱滴定羧基到终点时羧基也不能完全解离，故不能用酸碱滴定法测定。若加入中性甲醛则其氨基与甲醛反应被保护起来使氨基酸不能生成两性离子，再以酚酞为指示剂用碱来滴定放出的H+，就能测定氨基酸的量。有关反应如下：（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱碱性DNP-氨基酸H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高（4）与丹磺酰氯反应（5）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”*以肽键相连接,肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基上的羟基与另一个氨基酸的-氨基上的氢原子脱水缩合而形成的化学键,如图示:三.氨基酸在蛋白质中的连接方式+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键H2NCC

OHR1HN

HCCOOH

R2CNOHOH*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*

肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。N末端：多肽链中有自由α-氨基的一端C末端：多肽链中有自由α-羧基的一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端C末端牛核糖核酸酶.几种生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+谷胱甘肽的生理功用：解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

体内许多激素属寡肽或多肽

神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽抗利尿素与催产素(9肽)、胰高血糖素（29肽）、脑啡肽（5肽）、降钙素（32肽）、促肾上腺皮质激素ACTH（39肽）、胰岛素（51肽）肌肽（2肽）、P物质（10肽、属神经肽类）、β内啡肽（31肽）蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第二节蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构.概念：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。一、蛋白质的一级结构.主要的化学键(主键)肽键，有些蛋白质还包括二硫键。方向:N

C;

或

NH2末端羧基末端.提示：一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。它由遗传密码决定,其上有酶切位点,一级结构可测定,并不同种属间有同源性.目录二、蛋白质的空间结构指蛋白质分子空间的三维结构,即立体,空间的构象，在蛋白质分子中各元素围绕某些化学键进行旋转,从而形成各种空间排布及相互关系(一).蛋白质的二级结构1.肽键平面(肽单元,肽平面,酰胺平面)是蛋白质的基本结构单位.如图:参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元

(peptideunit)

。肽键平面—形成二级结构的基础有关对肽键平面的描述？2.二级结构的概念与基本形式A.概念:一条多肽链中局部原子的空间排佈B.二级结构的基本形式（1）

-螺旋(-helix)

（2）

-折叠(-pleatedsheet)（3）

-转角(-turn)（4）不规则卷曲(randomcoil)

（1）、α螺旋特点

①螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100°。

②每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键（hydrogenbond），氢键的走向平行于螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。③R侧链基团伸向螺旋的外侧。

④Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经常出现在α-螺旋的端头，它改变多肽链的方向并终止螺旋。（2）、β折叠特点

是一种肽链相当伸展的结构。肽链按层排列，依靠相邻肽链上的羰基和氨基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折叠成片，氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面。（3）、β转角（4）、无规则卷曲

-螺旋目录RRRRRRRRR-折叠-折叠NCNCNCNC维系力:链内或链间氢键NC-转角-转角转角,含4个AA,3个肽键平面?β-转角

①

180°的转角部位②由4个氨基酸残基构成③由第一个残基的羰基氧（O）与第四个残基的氨基氢（H）可形成氢键④多含脯氨酸和甘氨酸不规则卷曲环或卷曲结构：无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。相对没有规律性的排布，但是其同样表现重要生物学功用。C.二级结构的维系力:氢键.超二级结构和结构域超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。钙结合蛋白中结合钙离子的结构域

锌指结构NCNC.氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。(二)、蛋白质的三级结构氢键、离子键、疏水键、VanderWaals力等。2.主要的化学键（维系力）一条多肽链中全部氨基酸残基(全部元素)的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。包括主链，側链的全部内容1.概念为非共价键，次级键（盐键）目录

肌红蛋白(Mb)肌红蛋白为单肽链蛋白质，含153个氨基酸残基，它含有8个α螺旋区，依次称为A到H螺旋，并含有β转角及环-卷曲等二级结构。

2.维系力亚基之间的结合力有疏水作用，VanderWaals力以及氢键和离子键,还有二硫键。（三）蛋白质的四级结构(或蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。)1.概念有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的四级结构.而每条多肽链被称为亚基(subunit)。.蛋白质的四级结构具有四级结构蛋白质reviewSummary三、蛋白质结构与功能的关系(一)、蛋白质的一级结构与功能的关系

(二)、蛋白质的空间结构与功能的关系.一级结构是空间构象的基础(一)、蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键.一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。（谷AA）（颉AA）

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。SSSSSSNNA链、21AAB链、30AA胰岛素A5A6A10B30人ThrSerIleThr猪ThrSerIleAla.肌红蛋白与血红蛋白的结构(二)、蛋白质空间结构与功能的关系目录.血红蛋白的构象变化与结合氧Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性.蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第三节蛋白质的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。一、蛋白质两性解离和等电点

PrCOOHNH3+OH-H+PrNH3+COO_OH-PrH+NH2COO-正离子pH＜pI两性离子pH﹦pI负离子pH＞pI蛋白质等电点蛋白质等电点pI胃蛋白酶1.0血清清蛋白4.7β-乳球蛋白

5.2血红蛋白6.7肌红蛋白7.0α-胰凝乳蛋白酶

8.3溶菌酶11.0二.蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力

*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚合沉淀三.蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。

引起变性的因素:物理、化学与生物学因素如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质——

破坏非共价键（次级键）和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。变性蛋白质的特点:

粘度增加，溶解度降低，易沉淀,易被蛋白酶降解,丧失生物学活性.

应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融合相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

四、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（与Trp、Phe、Tyr有关）五、蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。A、蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。生物化学技术：&.透析（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。*

免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。bindingwashelution免疫沉淀抗体ProteinA-agarose（三）电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。根据支撑物的不同，可分