【生物课件】分子生物学基本知识(上)

分子生物学基本知识

核酸的结构与功能••核酸的化学组成

核酸的结构与功能

TheStructureandFunctionofNucleicAcid

1868年，瑞士的内科医生FriedrichMiescher从外科医院包扎伤口的绷带上的脓

细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；后来他

又从鳍鱼精子中分离出类似的物质，并指出它是由一种碱性蛋白质与一种酸性物

质组成的，此酸性物质即是现在所知的核酸(nucleicacid)。1944年Oswald

Avery,ColinMacleod和MaclynMcCarty发现，•种有夹膜、具致病性的肺炎球

菌中提取的核酸将NA(deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸)，可使另一种无夹膜,

不具致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变，转变为有夹膜，具致病性的肺炎球

菌.，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，转化就不

发生。该项实验彻底纠正了蛋白质携带遗传信息这一错误认识，确立了核酸是遗

传物质的重要地位；DNA遗传作用的进一步肯定来自AlfredHershey和Martha

Chase对一个感染大肠杆菌的病毒的研究。即用放谢性同位素32P标记噬菌体

DNA,35s标记其蛋白质外壳，再用标记的噬菌体去感染培养的大肠杆菌，结果

发现进入细菌体内，使细菌生长、繁殖发生变化的是32P标记的DNA,而不是

35s标记的蛋白质，并且新繁殖生成的噬菌体不含35S,只含32P。1953年

Watson和Crick创立的DNA双螺旋结构模型，不仅阐明了DNA分子的结构特

征，而且提出了DNA作为执行生物遗传功能的分子，从亲代到子代的DNA复

制(replication)过程中，遗传信息的传递方式及高度保真性，为遗传学进入分子水

平奠定了基础，成为现代分子生物学发展史上最为辉煌的里程碑。后来的研究又

发现了另一类核酸泰NA(ribonucleicacid,核糖核酸)，RNA在遗传信息的传递中

起着重要的作用。从此，核酸研究的进展日新月异，如今，由核酸研究而产生的

分子生物学及其基因工程技术已渗透到医药学、农业、化工等领域的各个学科，

人类对生命本质的认识进入了一个崭新的天地。

核酸的化学组成

核酸是生物体内的高分子化合物，包括DNA和RNA两大类。

一、元素组成

组成核酸的元素有C、H、0、N、P等，与蛋白质比较，其组成上有两个特点：

一是核酸•般不含元素S,二是核酸中P元素的含量较多并且恒定，约占9〜10%。

因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定P含量来代表核酸量。

二、化学组成与基本单位

核酸经水解可得到很多核甘酸，因此核甘酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多

单核甘酸聚合形成的多聚核甘酸。核甘酸可被水解产生核甘和磷酸，核甘还可再

进一步水解，产生戊糖和含

氮碱基(图1)。戊糖(pentose)

藏基(bace)

(nucleotide)(nucleoside)

图I核酸的组成

核甘酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于喋吟衍生物和嗑咤衍生物。

核甘酸中的噪吟碱(purine)主要是鸟喋吟(guanine,G)和腺喋吟(adenine,A),喀陡碱

(pyrimidine)主要是胞喀咤(cytosine。)、尿口密唯(uracil,U)和胸腺口密喔(thymine,T)。

DNA和RNA都含有鸟噂吟(G)、腺噂吟(A)和胞口密嗟(C)；胸腺喀咤(T)一般而言

只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿喀咤(U)只存在于RNA中，不存在

于DNA中。它们的化学结构请参见图示。

7

$

胞喳唯尿嚅陡的原嗤腕

(2一辄4一史薨女味)(2,4-二氧唔咂)(5-甲基尿流嗓)

核酸中五种碱基中的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位，可以发生酮式

一-烯醇式或氨基亚氨基之间的结构互变。这种互变异构在基因的突变和生物的

进化中具有重要作用。

有些核酸中还含有修饰碱基(modi行edcomponent),(或稀有碱基，unusualcom

ponent),这些碱基大多是在上述喋吟或嘴咤碱的不同部位甲基化(methylation)或

进行其它的化学修饰而形成的衍生物。一般这些碱基在核酸中的含量稀少，在各

种类型核酸中的分布也不均一。DNA中的修饰碱基主要见于噬菌体DNA,如5-

甲基胞口密咤(m5C),5-羟甲基胞口密咤hm5C；RNA中以tRNA含修饰碱基最多，

如1-甲基腺喋吟(mlA),2,2一二甲基鸟噪吟(m22G)和5,6-二氢尿嗑咤(DHU)

等。

1-甲基腕味吟(m'A)22—二甲基鸟原吟3太｝)5,6一二算尿嗡喽IDHU)

喋吟和喀喘环中含有共辗双键，对260nm左右波长的紫外光有较强的吸收。碱

基的这一特性常被用来对碱基、核甘、核甘酸和核酸进行定性和定量分析。

核酸中的戊糖有核糖(ribose)和脱氧核糖(deoxyribose)两种，分别存在于核糖核昔

酸和脱氧核糖核甘酸中。为了与碱基标号相区别，通常将戊糖的C原子编号都

加上如CU表示糖的第一位碳原子。

戊糖与喀嗡或喋吟碱以糖背键连接就称为核背,通常是戊糖的C「与嗒喔碱的N1

或喋吟碱的N9相连接。

核昔中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核甘酸。生物体内的核甘酸大多

数是核糖或脱氧核糖的C5,上羟基被磷酸酯化，形成5,核甘酸。核甘酸在5,进一

步磷酸化即生成二磷酸核苗和三磷酸核甘。以核糖腺甘酸为例，除AMP外，还

有二磷酸腺甘(ADP,adenosine5'—diphosphate)和三磷酸腺甘(ATP,adenosine

51triphosphate)两种形式。核昔酸的二磷酸酯和三磷酸酯多为核甘酸有关代谢的

中间产物或者酶活性和代谢的调节物质，以及作为核甘酸有关代谢的中间产物或

者酶活性和代谢的调节物质，以及作为生理储能和供能的重要形式。

核甘酸还有环化的形式。它们主要是3、5，一环化腺甘酸(cAMP,adenosine3；5，

-cyclicmonophosphate)和3',5'一环化鸟甘酸(cGMP,guanosine3',5f—cyclic

monophosphate),化学结构如下。环化核甘酸在细胞内代谢的调节和跨细胞膜信

号中起着十分重要的作用。

T,，'一开化等背敞SAMP)

3',$一环化岛4酸化61P)

表1核甘酸及相应的核甘、碱基名称中英文对照表

核甘酸核背碱基

腺甘酸(AMP)腺背腺喋吟(A)

adenosinemonophosphateadenosineadenine

脱氧腺甘酸(dAMP)脱氧腺昔

deoxydenosinemonophosphatedeoxyadenosine

鸟甘酸(GMP)鸟背鸟喋吟(G)

guanosinemonophosphateguanosineguanine

脱氧鸟甘酸(dGMP)脱氧鸟背

deoxyguanosinemonophosphatedeoxyguanosine

胞昔酸(CMP)胞普胞喀咤(C)

cytidinemonophosphatecytidinecytosine

胞氧胞甘酸(dCMP)脱氧胞甘

deoxycytidinemonophosphatedeoxycytidine

胸甘酸(TMP/dTMP)胸一胸腺胸碇(T)

thymidinemonophatethymidinethymine

尿甘酸(UMP)尿昔尿喀咤(U)

uridinemonophosphateuridineuracil

DNA的一级结构与功能

(一)DNA的一级结构

核酸是由很多单核甘酸聚合形成的多聚核:仔酸(polynucleotide),DNA的一级结构

即是指四种核甘酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照•定的排列顺序，通过

磷酸二酯键连接形成的多核甘酸，由于核甘酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故

又可称为碱基顺序。核甘酸之间的连接方式是：一个核甘酸的5位磷酸与下一位

核甘酸的310H形成二，5,磷酸二酯键，构成不分支的线性大分子，其中磷酸基

和戊糖基构成DNA链的骨架，可变部分是碱基排列顺序。核酸是有方向性的分

子，即核甘酸的戊糖基的5位不再与其它核甘酸相连的5,末端，以及核甘酸的戊

糖基3位不再连有其它核苜酸的3,末端，两个末端并不相同，生物学特性也有差

异。

寡核苜酸(oligonucleotide)是指二至十个甚至更多个核甘酸残基以磷酸二酯键连

接而成的线性多核甘酸片段。目前多由仪器自动合成而用作DNA合成的引物

(Primer)、基因探针(probe)等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。

表示一个核酸分子结构的方法由繁至简有许多种(图1)。由于核酸分子结构除了

两端和碱基排列顺序不同外，其它的均相同。因此，在核酸分子结构的简式表示

方法中，仅须注明一个核酸分子的哪一端是5,末端，哪一端是3,末端，末端有无

磷酸基，以及核酸分子中的碱基顺序即可。如未特别注明5,和3,末端，一般约定,

碱基序列的书写是由左向右书写，左侧是5,末端，右侧为3,末端。

$pGpApApTpTpCOHy

ypGpAATTC-OHy

y-GA.\TTC-r

I

GAATTC

图1核酸分子结构的表示方式

(二)基因组DNA

自然界绝大多数生物体的遗传信息贮存在DNA的核音酸排列顺序中。DNA是巨

大的生物高分子，一般将细胞内遗传信息的携带者素染色体所包含的DNA总体

称为基因组(genome)。同--物种的基因组DNA含量总是恒定的，不同物种间基

因组大小和复杂程度则差异极大，一般讲，进化程度越高的生物体其基因组构成

越大、越复杂，见(表1)。

表1某些有代表性的生物体内DNA大小

分子量碱基对(bp)千碱基对(kb)

最简单的微生

SV40病毒3x1065x1035

物

入噬菌体3.4x1075x10450

细菌大肠杆菌2.2x1094.6x1064600

哺乳动物小鼠1.5x10122.3x109230万

人1.8x10122.8x109280万

DNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位，即基因(gene)。基

因的功能取决于DNA的一级结构。一个DNA分子能携带多少基因呢?如果以

1000〜1500bp编码一个基因计算，猿猴病毒SV40基因组DNA有5000碱基对

(basepair,bp),可编码5种基因，人类基因组含3'10加DNA,理论上可编码200

万以上的基因，然而，由于哺乳动物的基因含有内含子(intron),因而每个基因可

长达5000〜8000bp,少数可达20,OOObpo按这样大小的基因进行推算，人类基

因组相当于40〜60万个基因。这可能吗?虽然现在还不知道确切数字，但利用核

酸杂交已测得哺乳类细胞含50,000-100,000种mRNA,由此推论整个基因

组所含基因不会超过10万个，只占全部基因组的6%,另外5〜10%为rRNA等

重复基因，其余80〜90%属于非编码区，没有直接的遗传学功能。DNA的复性

动力学研究发现这些非编码区往往都是一些大量的重复序列，这些重复序列或集

中成簇，或分散在基因之间，可能在DNA复制、调控中具有重要意义，并与生

物进化、种族特异性有关。可见原核细胞由于DNA分子较小，必须充分利用有

限的核甘酸序列，这是真核基因组与原核基因组显然不同之处。

真核基因组与原核基因组在结构上还有很多不同的特点，归纳如下：

1.真核生物基因组结构特点

①真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细

胞外，体细胞内的基因组是双份的(即双倍体，diploid),即有两份同源的基因组。

②真核细胞基因转录产物为单顺反子(monocistron),即一个结构基因转录、翻译

成一个mRNA分子，一条多肽链。

③存在大量重复序列，即在整个DNA中有许多重复出现的核甘酸顺序，重复序

列长度可长可短，短的仅含两个核甘酸，长的多达数百、乃至上千。重复频率也

不尽相同；高度重复序列重复频率可达106次，包括卫星DNA、反向重复序列

和较复杂的重复单位组成的重复序列；中度重复序列可达103〜104次，如为数

众多的Ahi家族序列，Kpnl家族，Hinf家族序列，以及一些编码区序列如rRNA

基因、tRNA基因、组蛋白基因等；单拷贝或低度重复序列，指在整个基因组中

只出现一次或很少几次的核甘酸序列，主要是编码蛋白质的结构基因，在人基因

组中占约60〜65%,因此所含信息量最大。

④基因组中不编码的区域多于编码区域。

⑤基因是不连续的，在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序

歹ll(interveningsequences),称为内含子(intron),编码区则称为外显子(exon)。内

含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后RNA中的内含子被切掉,

外显子连接在一起成为成熟的mRNA,作为指导蛋白质合成的模板。

⑥基因组远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较

小。

2.原核生物基因组结构特点

①基因组较小，没有核膜包裹，且形式多样，如病毒基因组可能是DNA,也可

能是RNA,可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分子，也可能是线性

分子；细菌染色体基因组则常为环状双链DNA分子，并与其中央的RNA和支

架蛋白构成-致密的区域，称为类核(nucleoid)。

②功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个mRNA分子中，称为

多顺反子mRNA(polycistronicmRNA),然后再加工成各种蛋白质的模板mRNA。

③DNA分子绝大部分用于编码蛋白质，不编码部分(又称间隔区)通常包含控制基

因表达的顺序。例如，噬菌体\(/X174中只有5%是非编码区。

④基因重叠是病毒基因组的结构特点，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三

种蛋白质分子。

⑤除真核细胞病毒外，基因是连续的，即不含内含子序列。

(三)限制性片段长度多态性

随着对基因认识的不断深入，发现在同种生物的不同个体之间，尽管其蛋白质产

物的结构和功能完全相同或仅存在着细微的差异，但在DNA水平却存在着差异,

尤其在不编码蛋白质的区域以及没有重要调节功能的区域表现更为突出。这种不

影响生物体表型的DNA突变被称为中性突变。

分子生物学技术的不断发展已使得从DNA水平直接分析这类突变成为可能。

目前应用较多且成熟的方法是限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlength

polymorphism,RFLP)o即当DNA序列中某一个碱基发生突变，使突变所在部位

的DNA序列获得或丢失某种限制性核酸内切酶位点；或当DNA分子内部发生

较大的顺序突变如缺失、重复、插入，或DNA高变区内某串联重复顺序的拷贝

数不同致使其两侧限制性核酸内切酶位点发生相对位移时，利用相应的限制性核

酸内切酶消化此DNA,便会产生与正常不同的限制性片段。这样，在同种生物

的不同个体中就会出现不同长度的限制性片段类型。

因为DNA的中性突变常以孟德尔显性遗传方式遗传给下一代，所以对这类突变

检测已广泛用于遗传病的诊断、产前诊断、亲子鉴定以及法医学上对罪犯的确认

等。

(四)DNA序列分析(DNAsequencing)

DNA的一级结构决定了基因的功能，欲想解释基因的生物学含义，首先必须知

道其DNA顺序。因此DNA序列分析是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。

1986年由美国学者提出的，目前正在实施的人类基因组计划(humangenome

project),则是要通过对人类基因组3xl09bp全序列的序列分析和人类基因的染色

体图谱制定达到了解其结构，认识其功能，即从分子遗传学水平来认识人类自身

的结构和功能特征的目的。

核酸的核甘酸序列测定方法已经过近20年的发展，因而测序的具体方法五花八

门、种类繁多。但是究其所依据的基本原理，不外乎Sanger的核酸链合成终止

法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。虽然原理不同，但这两种方法都同

样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核甘酸，每组寡核甘酸都有固定的起

点，但却随机终止于特定的一种或多种残基上。由于DNA链上每一个碱基出现

在可变终止端的机会均等，因而上述每一组产物都是一些寡核甘酸的混合物，这

些寡核甘酸的长度由某一种特定碱基在原DNA片段上的位置所决定。然后在可

以区分长度仅相差一个核甘酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核甘酸进行

电泳分析，只要把儿组寡核甘酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可

从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核甘酸顺序。以下分别介绍。

LSanger双脱氧链终止法

DNA的合成总是从5,端向3,端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导核

酸链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3,末端，依据碱基配对的原则，

通过生成新的3，，5，一磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。具

体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以

及四种脱氧核甘酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苜酸，使

其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不

同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离

开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核甘酸序列（图2）。

?9V

0ssp-p-P闾挈

Uo

工3,一双戌笈松甘酸2,脱气核仔城

(ddNTP)idNTP)

夕dAdAdTd比CdCdTdAdGdCdCdCdTdAdGdCT

3'dRiniAdAilCdGd&ITdOJCICgd人dTdCdGA'

dATPJAIPGATPdATP

dGTP<«HFcGTPdor?

dCTPdCTPcCHPMVP

dTIPJTTPerrpdTTP

♦▼+4

ddATPddGTPddTTP

•l!

5，l^jAdiaiaGdQrHtAoGdCMGrHklTdAdGiMCC

5*-队JAdTdTWSdAaGdCdGdCdTdAldGG

y-(IAd.MTdTdGdtUTiAdGdCdGdCdTddAA

5*d7AdTdTdGdQTraAdGdCdGdOWTT

5*-dAJAdTdTdGdOiTJAJGdCJGU^T<*

$•-d加包"DfMGdQnUMGdCdJGG

5*-dAl.AdTdTdGdCdrdAdGddCC

5•-d心4ndTdCdCdTtfAddGG

S*-dAiAdTlidGdQlTddAA

5,dAlAd-rtTdGdOddTT

y-dMAdTdTilC4dCC

Jr-dAJAdTdTddGO

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$・dMAdUTT

5»-dAddAA

”"A所邮T列*

图2双脱氧链终止法测定DNA序列原理示意

2.MaxamGilbertDNA化学降解法

这一方法的基本步骤为（1）先将DNA的末端之一进行标记（通常为放射性同位素

32P；（2）在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；（3）在修饰

碱基位置化学法断开DNA链；（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；

（5）根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核甘酸序列（图3）。

5*HO-GATCGGAOCT3'

典端放射同位It标记

(*t例为£-末端标记)

yJ,PGATCGGACCTT

不完全修饰

修饰G像饰G和A修饰TfaC修饰C

化学裂解

电泳分商

全长核做

ffl

'TGATOGGACCH

n

泳PGATCGGAC[C]

“PGATCGGA©

hgATOGG因

»POATOGK2

向方PGATCG

«PGA1[Ci

,;PGAE

口表示蔚修饰威基及断裂佗皆

图3化学裂解法测定DNA的核甘酸序列

DNA的二级结构与功能

(•)DNA的二级结构双螺旋结构模型(doublehelixmodel)

1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型，揭示了遗

传信息是如何储存在DNA分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持。这是

生物学发展的重大里程碑。

在DNA双螺旋结构模型建立之前，早在1868年，Miescher已经从脓细胞提取

到核酸与蛋白质的复合物，当时称为核素(nuclein)。但核酸在生命活动中的重要

地位，却迟至本世纪50年代才被认识。

本世纪20年代，Levene研究了核酸的化学结构并提出四核甘酸假说；40年代末,

Avery,Hershey和Chase的实验严密地证实了DNA就是遗传物质；50年代初，

Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基

定量分析，发现DNA碱基组成有如下规律(表l)o

表1不同生物来源的DNA四种碱基比例关系

胸腺喀咤胞嗑咤(A+T)/

DNA来源腺噪吟(A)鸟喋吟(G)

(T)(C)(G+C)

大肠杆菌25.424.824.125.71.01

小麦26.828.023.222.71.21

鼠29.725.621.922.81.21

猪：肝29.429.720.520.5

胸腺30.028.920.420.71.43

脾29.629.220.420.8

酵母31.332.918.717.51.079

(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；

(2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；

(3)几乎所有的DNA,无论种属来源如何，其腺噂口令摩尔含量与胸腺喀咤摩尔含

量相同(A]=[T),鸟嗯吟摩尔含量与胞口密唯摩尔含量相同(G]=[C),总的嗯

吟摩尔含量与总的口密喘摩尔含量相同([A+G]=[C]+[T)o

(4)不同生物来源的DNA碱基组成不同，表现在A+T/G+C比值的不同；

这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。

Watson和Crick以立体化学原理为准则，对Wilkins和Franklin的DNAX射线

衍射分析结果加以研究，提出了DNA结构的双螺旋模式，其主要内容如下：

图1DNA的双螺旋结构模式

A.正面观：长方框内有详细说明，S代表脱氧核糖。

B.俯视：涂黑的是碱基，此处全部碱基都是嗑嗟，只看到糖的侧面略呈三角形，

最外围是磷酸及其酯键。

(1)在DNA分子中，两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构，

双螺旋的螺距为3.4nm,直径为2.0nm。(图1,A,B)。

(2)链的骨架(backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双

螺旋的外侧。

(3)碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的喋吟和口密咤碱基以其疏水的、近于平面

的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链中的喋吟碱基与

另一股链中位于同…平面的口密唯碱基之间以氢链相连，称为碱基互补配对或碱基

配对(basepairing),碱基对层间的距离为0.34nm。碱基互补配对总是出现于腺喋

吟与胸腺嗑碇之间(A=T),形成两个氢键；或者出现于鸟喋吟与胞口密咤之间

(G=C),形成三个氢键。(图2)。

图2A-T,G—C间的氢键形成

(4)DNA双螺旋中的两股链走向是反平行的，一股链是走向，另--股链是

3走向。两股链之间在空间上形成一条大沟(majorgroove)和一条小沟(minor

groove),这是蛋白质识别DNA的碱基序列，与其发生相互作用的基础。

DNA双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层间的堆积力

(basestackingforce)维系。DNA双螺旋中两股链中碱基互补的特点，逻辑地预

示了DNA复制过程是先将DNA分子中的两股链分离开，然后以每一股链为模

板(亲本)，通过碱基互补原则合成相应的互补链(复本)，形成两个完全相同的

DNA分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲链，即保留了一半亲链，将

这种复制方式称为DNA的半保留复制(semiconservativereplication)。后来证明,

半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。

DNA双螺旋是核酸二级结构的重要形式。双螺旋结构理论支配了近代核酸结构

功能的研究和发展，是生命科学发展史上的杰出贡献。

(二)DNA结构的多态性

Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构属于B型双螺旋，它是以在生理盐溶液

中抽出的DNA纤维在92%相对湿度下进行X一射线衍射图谱为依据进行推测

的，这是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构。然而以后的研究表

明DNA的结构是动态的。在以钾或绝作反离子，相对湿度为75%时，DNA分

子的X—射线衍射图给出的是A构象，A—DNA每螺旋含11个碱基对;而且变

成A—DNA后，大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅。由于大沟、小沟是DNA行

使功能时蛋白质的识别位点，所以由B—DNA变为A—DNA后，蛋白质对DNA

分子的识别也发生了相应变化。

一般说来,A-T丰富的DNA片段常呈B-DNA。采用乙醇沉淀法纯化DNA时,

整个过程中,大部分DNA由B-DNA经过C—DNA,最终变构为A—DNA。

若DNA双链中一条链被相应的RNA链所替换，会变构成A-DNAo当DNA处

于转录状态时，DNA模板链与由它转录所得的RNA链间形成的双链就是A-

DNAo由此可见A-DNA构象对基因表达有重要意义。此外，B—DNA双链都

被RNA链所取代而得到由两条RNA链组成的双螺旋结构也是A—DNA。除A

一DNA、B-DNA螺旋外，还存在B，-DNA、C—DNA、D—DNA等，其结构

参数见表2。

表2不同右手双螺旋DNA的结构参数

双螺旋碱基倾碱基夹碱基间距螺距每轮碱小沟宽/nmx大沟宽nmx

角/（。）角（。）/nm/nm基数小沟宽nm大沟宽nm

B-DNA036.00.3373.4100.57x0.751.17x0.85

C-DNA638.00.3313.19.30.48x0.791.05x0.75

D-DNA45.00.3030.13x0.670.89x0.58

A-DAN2032.70.2562.8111.10x0.280.27x1.35

总之，DNA的双螺旋结构永远处于动态平衡中，DNA分子构象的变化与糖基和

碱基之间空间相对位置有关。

1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG单晶的X-射线衍射图

谱时出人意料地发现这种六聚体的构象与上面讲到的完全不同。它是左手双螺

旋，与右手螺旋的不同是螺距延长（4.5nm左右），直径变窄（L8nm）,每个螺旋含

12个碱基对，分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿形排列，有如“之”字形

一样，因此叫它Z构象（英文字Zigzag的第一个字母）。还有，这一构象中的重复

单位是二核甘酸而不是单核甘酸；而且ZDNA只有一个螺旋沟，它相当于B

构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在（图3）。进一步的分析还证明，Z-

DNA的形成是DNA单链上出现喋吟与嗑咤交替排列所成的。比如CGCGCGCG

或者CACACACAo

Z-ONA8-UNA

图3Z—DNA和B-DNA

Z-DNA有什么生物学意义呢?应当指出Z-DNA的形成通常在热力学上是不利

的。因为Z—DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产生静电排斥。但是,

DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。DNA解螺旋却是DNA

复制和转录等过程中必要的环节，因此认为这一结构与基因调节有关。比如SV40

增强子区中就有此结构，乂如鼠类微小病毒DNS复制区起始点附近有GC交替

排列序列。此外，DNA螺旋上沟的特征在其信息表达过程中起关键作用。调控

蛋白都是通过其分子上特定的氨基酸侧链与DNA双螺旋沟中的碱基对一侧的氢

原子供体或受体相互作用，形成氢键从而识别DNA上的遗传信息的。大沟所带

的遗传信息比小沟多。沟的宽窄和深浅也直接影响到调控蛋白质对DNA信息的

识别。ZDNA中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化。这

些都暗示ZDNA的存在不仅仅是由于DNA中出现喋吟一咤喀交替排列之结

果，也一定是在漫漫的进化长河中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果，

有其内在而深刻的含意，只是人们还未充分认识而已。

DNA构象的可变性，或者说DNA二级结构的多态性的发现拓宽了人们的视野。

原来，生物体中最为稳定的遗传物质也可以采用不同的姿态来实现其丰富多采的

生物学功能。

多年来，DNA结构的研究手段主要是X射线衍射技术，其结果是通过间接观测

多个DNA分子有关结构参数的平均值而获得的。同时，这项技术的样品分析条

件使被测DNA分子与天然状态相差甚远。因此，在反映DNA结构真实性方面

这种方法存在着缺陷。1989年，应用扫描隧道显微镜(scanningtummeling

microscopy,STM)研究DNA结构克服了上述技术的缺陷。这种先进的显微技术，

不仅可将被测物放大500万倍，且能直接观测接近天然条件下单个DNA分子的

结构细节。STM技术的应用是DNA结构研究中的重要进展，可望在探索DNA

结构的某些未知点上展示巨大潜力。

(三)DNA结构的不均一，性(heterogeneity)

在DNA的一级结构中，四种碱基A,T,C,G远非均匀分布，尽管双螺旋的构

型大体相同，但沿着DNA链各处的物理结构不完全相同，各处双螺旋的稳定性

也就显示出差别，充分体现了DNA一级结构决定高级结构的原理。其不均--性

主要有：

1.反向重复序列(invertedrepeats)

又称回文序列(palindrome),它能在DNA或RNA中形成发夹结构。这种回文结

构通常是作为'•种特别信号，如限制性核酸内切酸(restrictionencl闩迥onuclease)

及调节蛋白的识别位点，转录终止信号等。

2.富含A/T的序列

在高等生物中，A+T与G+C的含量差不多相等，然而在它们的染色体某一区域,

A-T含量可能相当高。如在很多有重要调节功能的DNA区段都富含A-T,特别

是在复制起点和启动子的Pribnow框（真核生物为TATA框）的序列中，其对于复

制和起始十分重要。因为A—T对只有二条氢键，此处的双链较G—C对处易于

解开，有利于起始复合物的形成。

3.噂吟和喀咤的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响。

人们考察了十种相邻的二核甘酸对（nearestneighbordoublets）,发现一个非常有

趣的现象，那就是碱基组成相同，但喋吟和喀嗟的排列顺序不同，双螺旋的稳定

性具有显著的差异。例如5，GC3，3，G5Kfl5，GC3，3，GC5,的稳定性相差很大,

前者的稳定性远大于后。它们的氢键数目是相同的，它们的差别在于相邻碱基之

间的堆集力不同。即从嗯吟到嗒嗡的方向的碱基堆集作用显著地大于同样组成的

喀喘到嗯吟方向的碱基堆集作用。（这里的方向就是常规的从5,端到3,端的方向）。

这是因为前者的喋吟环和嗑咤环重迭面积大于后者的口密嗟环和喋吟环的重迭面

积，这在B型DNA中确是如此。

根据Gotoh1981年的研究，十种相邻二核甘酸对的Tm值如表3所示，单位为

℃,所用离子强度为19.5mmol/LNa+o

表3相邻二核甘酸对Tm值

3，

ATGC

A54.5057.0258.4297.73

T36.7354.5054.7186.44

5，

G86.4497.7385.97136.12

C54.7158.4272.5585.97

由表15-5可以看到，5TA3,3，AT5,的Tm值最低。在真核生物中，常可以在19

到27的位置上看到一个叫做TATA框的结构（又称Hogness框），这是RNA聚

合酶的结合位点。在这里RNA聚合酶和有关蛋白质因子形成转录起始复合物。

又如，生命有机体选择UAA作为最有效的终止密码子绝不是偶然的，因为64

个三联体密码子中，它与反密码子（假定有的话）形成的互补产物5UAA3，

3，AUU5,的Tm值是最低的一个，即使在生理温度下也是不稳定的。当初有人花

了很多工夫去寻找一个不携带氨基酸的专供肽链终止用的tRNA,其实并不存在

这种tRNA。肽链的释放是由释放因子RF在起作用。在三种终止密码子中，UAG

和UGA常会为突变型的tRNA无义抑制，而UAA则很少发生无义抑制也可能

就是这个道理。这也就说明了为什么在肽链终止处常常会出现双重终止密码子。

（四）DNA的变性、复性与分子杂交

DNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释DNA的重要特

性素变性与复性，这对于深入了解DNA分子结构与功能的关系又有重要意义。

1.DNA变性（denaturation）

指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双

螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改

变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、

尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。变性DNA常发生一些理化及生物学

性质的改变：

溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无

规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。

溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变,

使DNA溶液的旋光性发生变化。

OD260ivn

图4核酸的解链曲线

增色效应(hyperchromiceffect)0指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。

DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的

特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱

基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。

对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA溶液在260nm处

的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变

化。若以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA变性曲线呈S

型(图4)。可见DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变

性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于

这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm,meltingtemperature)。在Tm

时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其G+C所

占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：

Tm=69.3+0.41(%G+C)

一定条件下（相对较短的核酸分子），Tm值大小还与核酸分子的长度有关，核酸

分子越长，Tm值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围

也较宽，反之亦然，因此DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。

2.DNA复性（renaturation）

指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现

象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过

程称之为退火（annealing）。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成（见后）。DNA

的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响：

温度和时间。一般认为比Tm低25c左右的温度是复性的最佳条件，越远离此

温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温

度下迅速冷却至低温（如4℃以下），复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此

方式保持DNA的变性（单链）状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复

性。

DNA浓度。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大。

DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（U）这二种单链序

列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得

多。在核酸复性研究中，定义了一个Cot的术语，（Co为单链DNA的起始浓度,

t是以秒为单位的时间），用以表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。在探讨

DNA顺序对复性速度的影响时，将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它

影响因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重缔合部分（在时间t时的复性率）

对Cot作图，可以得到如图5所示的曲线。曲线上方为示复杂性的核酸分子的非

重复碱基对数。如多聚（A）的复杂性为1,重复的（ATGC）n组成的多聚体的复杂

性为4,分子长度是105核昔酸对的非重复DNA的复杂性为105o原核生物基

因组均为非重复顺序，故以非重复核甘酸对表示的复杂性直接体现基因组大小

（图上方的箭头所指为基因大小），对于真核生物基因组中的非重复片段也是如

此。在标准条件下（一般为0.18ml/L阳离子浓度，400核甘酸长的片段）测得的复

性率达0.5时的Cot值（称Cotl/2）,与核昔酸对的复杂性成正比。对于原核生物

核酸分子，此值可代表基因组的大小及基因组中核甘酸对的复杂程度。真核基因

组中因含有许多不同程度的重复序列(repetitivesequence),所得到的Cot曲线更

为复杂。

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图5不同物种核酸的Cot曲线

DNA的变性和复性原理，现已在医学和生命科学上得到广泛的应用。如核酸杂

交与探针技术，聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术等。

3.分子杂交：(hybridization)

不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核甘

酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之

间，形成所谓的杂化双链(heteroduplex),这个过程称为杂交(hybridization)图6,

I)。杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA与RNA之间和DNA

与RNA之间。例如，一段天然的DNA和这段DNA的缺失突变体(假定这种突

变是DNA分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双

链中部鼓起小泡。测量小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多

少。核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核

酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序

列以确定它们在进化中的关系。其应用当然远不止于确定突变位置这一例（图

6ll）o

图6核酸杂交及其应用示意图

I.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链

II.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失

的部分；

D是显示从天然DNA链鼓出小泡HL粗线代表探针，粗线上的X表示放射性

标记

在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针

技术（Probe）。一小段（例如十数个至数百个）核甘酸聚合体的单链，有放射性同位

素如32P、35s或生物素标记其末端或全链，就可作为探针。把待测DNA变性

并吸附在一种特殊的滤膜，例如硝酸纤维素膜上。然后把滤膜与探针共同培育一

段时间，使发生杂交。用缓冲液冲洗膜。由于这种滤膜能较牢固地吸附双链的核

酸，单链的在冲洗时洗脱了。带有放射性的探针若能与待测DNA结合成杂化双

链，则保留在滤膜上。通过同位素的放射自显影或生物素的化学显色，就可判断

探针是否与被测的DNA发生杂交。有杂交现象则说明被测DNA与探针有同源

性(homogeneity)，即二者的碱基序列是可以互补的。例如：想知道某种病毒是否

和某种肿瘤有关，可把病毒的DNA制成探针。从肿瘤组织提取DNA,与探针杂

交处理后，有杂化双链的出现，就说明两种DNA之间有同源性。这不等于可以

说这种病毒引起肿瘤，但至少这是可以继续深入研究下去的一条重要线索。

探针技术(图6III)在遗传性疾病诊断上已开始应用。例如诊断地中海贫血或血红

蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取DNA,这就是诊断探针。用诊断探

针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性遗传

性疾病。从胎儿的羊水也可以提取到少量DNA。由于探针技术比较灵敏，就使

遗传性疾病的产前诊断较为容易办得到了。杂交和探针技术是许多分子生物学技

术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。

DNA的三级结构与功能

(―)DNA超螺旋

双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主

要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，

现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，

这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil),如图

15-11所示。有些单链环形染色体(如小174)或双链线形染色体(如噬菌体入)，在

其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，

虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的

DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。超螺

旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体

形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由

DNA拓扑异构酶产生的。

图1Opencircular(a)andsupercoiled(b)formsofPM2virusDNA,Bar

represents0.2pm.(BycourtesyofDrLesleyCoggins)

(二)染色质和核小体

1.染色质

真核生物的染色体(chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质

(chromatin)的形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最

基本的单位素核小体(nucleosome)成串排列而成的。DNA是染色体的主要化学成

分，也是遗传信息的载体，约占染色体全部成分的27%,另外组蛋白和非组蛋白

占66%,RNA占6%o

组蛋白(histones)是一种碱性蛋白质，等电点一般在PH10.0以上，其特点是富含

二种碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，根据这两种氨基酸在蛋白质分子中的相对比

例，将组蛋白分为五种类型(表1)。

表1五种组蛋白分子的基本参数

种类型碱性氨基酸酸性碱性氨基酸/酸氨基分子核小

类性氨基酸酸量体

氨基

LysArgLys/Arg

酸残基上位

数置

23连接

H1极度富含Lys29%1%295%5.4215

000*

14

H2A11%9%1.215%1.4129核心

500

13

ff，，

H2B16%6%2.713%1.7125