基因工程第二章基因工程的基本操作程序

基因工程第二章基因工程的基本操作程序第1页，课件共66页，创作于2023年2月一.目的基因(TargetDNA)制备制备DNA片段可通过5个途径：1、从生物基因组群体中分离目的基因2、人工合成3、PCR反应合成DNA4、mRNA差异显示法获得目的基因5、机械的方法如超声波把基因组打成片段目的基因是指准备导入受体细胞的，以研究或应用为目的所需要的外源基因。片段来源：原核生物和真核生物第2页，课件共66页，创作于2023年2月1、从生物基因组群体中分离目的基因主要有以下几种方法：限制性内切酶法（鸟枪法）mRNA或cDNA钓取法（反转录法）第3页，课件共66页，创作于2023年2月A鸟枪法（霰弹法）美国塞莱拉遗传公司创始人雷格·文特发明的，是20世纪最伟大的生物技术发明之一。鸟枪法是将基因组打成小片段进行测序，然后再利用计算机对这些片段进行排序和组装，重新组装成一个完整的基因组。鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性第4页，课件共66页，创作于2023年2月

鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离第5页，课件共66页，创作于2023年2月染色体的切断与载体连接转化受体细胞筛选含目的基因的重组子鸟枪法克隆目的基因的基本战略第6页，课件共66页，创作于2023年2月1、染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接,

但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，

目的基因完整第7页，课件共66页，创作于2023年2月与载体连接如果采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体第8页，课件共66页，创作于2023年2月如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞转化受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）第9页，课件共66页，创作于2023年2月鸟枪法操作的改进（一）使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA第10页，课件共66页，创作于2023年2月鸟枪法操作的改进（二）例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接2.0kb1.6kb1.8kb在连接前将DNA片段进行分级分离第11页，课件共66页，创作于2023年2月鸟枪法操作的改进凝胶DNA片段回收技术冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法第12页，课件共66页，创作于2023年2月鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构第13页，课件共66页，创作于2023年2月BcDNA法cDNA法克隆目的基因的基本方法cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。第14页，课件共66页，创作于2023年2月提取细胞总mRNA，合成总cDNA第15页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA法克隆目的基因的基本方法mDNA（1）cDNA第一链的合成

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5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs第16页，课件共66页，创作于2023年2月（2）cDNA第二链的合成自身引导法置换合成法引导合成法第17页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA第二链的合成煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失第18页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA第二链的合成

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3’3’T4-DNAligase置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失第19页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA第二链的合成

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3’NaOH退火KlenowdNTPs引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列第20页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA法克隆目的基因的基本方法双链cDNA的克隆

双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收

平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收第21页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序

提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等第22页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA法分离目的基因的基本程序特异分离程序

提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等第23页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序

利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能第24页，课件共66页，创作于2023年2月差异分离程序

多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆第25页，课件共66页，创作于2023年2月cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构

细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因

第26页，课件共66页，创作于2023年2月CPCR法PCR(PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物PCR法定向扩增目的基因的基本原理第27页，课件共66页，创作于2023年2月5‘5‘目的基因5‘变性加热5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加热变性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123第28页，课件共66页，创作于2023年2月

由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR扩增产物T载体T7lacZMCSoriApr第29页，课件共66页，创作于2023年2月D化学合成法化学合成法的基本方法化学合成的单元操作DNA化学合成的用途第30页，课件共66页，创作于2023年2月化学合成法的基本方法全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：（1）小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

第31页，课件共66页，创作于2023年2月化学合成法的基本方法全基因合成混合退火（2）补钉延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

Klenow酶聚合第32页，课件共66页，创作于2023年2月化学合成法的基本方法全基因合成（3）大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

Klenow酶聚合第33页，课件共66页，创作于2023年2月化学合成法的基本方法全基因合成

上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%第34页，课件共66页，创作于2023年2月生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域化学合成法的基本方法探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子。由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题:第35页，课件共66页，创作于2023年2月化学合成法的基本方法探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列CysMetAspGluMetLysArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTCCGACGGCGTCGC设计的简并探针序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGAAG此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计expressedsequencetag第36页，课件共66页，创作于2023年2月化学合成的单元操作

化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的第37页，课件共66页，创作于2023年2月化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂第38页，课件共66页，创作于2023年2月DNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因设计新型基因制备探针、引物、接头如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等

第39页，课件共66页，创作于2023年2月二．DNA片段与载体DNA体外重组外原基因（DNA片段）很难直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到限制性内切酶的作用而分解。要将外源基因导入受体细胞，必须选择适当的载体。第40页，课件共66页，创作于2023年2月作为载体的DNA分子所具备的条件：1、容易进入寄主细胞2、进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达。3、容易从宿主细胞中分离纯化常用的载体：质粒、噬菌体、病毒和粘粒载体是外源基因进入受体细胞的工具。第41页，课件共66页，创作于2023年2月DNA重组技术核心步骤：DNA片段的体外连接本质：涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程载体：质粒和温和噬菌体需两大酶：DNA限制性内切酶和DNA连接酶此外：DNA聚合酶、逆转录酶、DNA修饰酶、RNA修饰酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等第42页，课件共66页，创作于2023年2月目的DNA片段被限制性内切酶消化后其末端可能有3种形式：带有相同的粘性末端带有互补的粘性末端带有平末端第43页，课件共66页，创作于2023年2月(1)粘性末端的连接第44页，课件共66页，创作于2023年2月(2)平末端的连接第45页，课件共66页，创作于2023年2月三．DNA重组体转入受体细胞1．受体细胞(特点)(1)转化率高(2)保持质粒稳定(3)营养缺陷型(4)其他标记不同的实验目的，使用不同的载体和受体细胞。第46页，课件共66页，创作于2023年2月2．DNA重组体进入受体细胞人为地诱导大肠杆菌这样的受体细胞进入感受态，主要采用两种途径(1)

化学处理(2)电击法第47页，课件共66页，创作于2023年2月四、目的基因的筛选和鉴定遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补

α-互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交

PCR限制性酶切图谱

第48页，课件共66页，创作于2023年2月第49页，课件共66页，创作于2023年2月第50页，课件共66页，创作于2023年2月第51页，课件共66页，创作于2023年2月IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)第52页，课件共66页，创作于2023年2月第53页，课件共66页，创作于2023年2月

bp—1534—994—

695—515—377—237

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第54页，课件共66页，创作于2023年2月第55页，课件共66页，创作于2023年2月第56页，课件共66页，创作于2023年2月表达系统:表达外源基因的宿主细胞原核表达系统:大肠杆菌真核表达系统:酵母,昆虫细胞,哺乳类动物细胞,植物细胞两大类五、克隆基因的表达载体有转