第十章维生素的测定2课件

第十章食品中维生素的测定

Chapter10DeterminationofVitamininFood教学要求：1、了解维生素的特点和分析意义

2、掌握几种维生素的基本测定方法和注意事项。本章重点：

不同维生素的测定方法及测定原理本章难点：

测定样品的前处理方法

第一节概述一、维生素(vitamin)的共性1、这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；2、它们的主要功能是作为辅酶的成分调节代谢过程，需要量很小；3、它们一般在体内不能合成或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取，长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。

二、测定的意义1、开发利用富含维生素的食品资源；2、指导人们合理调节膳食结构，防止维生素缺乏症；3、指导制定合理的工艺条件及储存条件，最大限度地保持各种维生素；4、监督维生素强化食品的强化剂量，防止应摄入过多而引起维生素中毒症等。

三、维生素分类

（根据溶解特性分类）P249表10—11、脂溶性维生素(fat-solublevitamin)A、D、E、K各小类；2、水溶性维生素(water-solublevitamin)B、C各小类。

四、分析方法1、生物鉴定法：不需详尽分离就能准确测定维生素的生物效能；但费时、费力、很少采用。2、微生物法：基于微生物生长需要特定的维生素，选择性较高，主要测定水溶性维生素，但耗时、操作要专门人员，目前还不能普及。3、仪器分析法：紫外法、荧光法灵敏、快速、有较好的选择性，是标准分析法；各种色谱法有越来越重要的作用；是一个非常活跃的领域。4、化学分析法：比色法、滴定法，具有快速、简便、不需特殊仪器等优点，普遍采用。第二节脂溶性维生素的测定

脂溶性维生素的理化特性：1、不溶于水，溶于有机溶剂。2、维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定；维生素E对酸稳定，对碱不稳定但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。3、维生素A、D、E耐热性好，能经受煮沸。维生素A易被氧化、D性质稳定不易被氧化、E在空气中能慢慢被氧化。测定思路：样品皂化——水洗去除类脂物——有机溶剂提取——浓缩、测定。

3、测定方法1）样品处理①皂化：称0.5～5.0g混匀的样品于锥形瓶中——10mL1：1KOH及20～40mL乙醇——电热板上回流30min——加10mL水稍振摇——无混浊现象为好。②提取：

皂化液移入分液漏斗内——30mL水分两次冲洗皂化瓶——再用50mL乙醚分两次冲洗皂化瓶——所有洗液并入分液漏斗中，振摇2min——分层后，水层放入第二分液漏斗——皂化瓶再用30mL乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二分液漏斗——将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一漏斗——多次进行至醚层不再使三氯化锑呈蓝色为止。

③洗涤：醚层漏斗内加30mL水轻振摇——静置后放出水分——加15～20mL0.5molKOH液轻振摇，静置后弃去下层碱层——再用水洗至酚酞不变红为止——醚层静置10～20min，放掉析出的水分。④浓缩：醚液经无水硫酸钠滤入三角瓶中——25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次——回流回收已醚，待瓶中只剩约5mL乙醚时取下——减压抽干——立即加入一定量的三氯甲烷（使维生素a的浓度在3～5μg范围内）备用。2）标准曲线的绘制3）样品测定4）结果计算4、说明及讨论1）若发生乳化现象，可加几滴乙醇破乳。2）每mL氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水，避免出现三氯化锑沉淀，干扰测定。3）在比色杯中加三氯化锑，立即测定，在6秒钟内完成。

4）防阳光照射分解维生素A，整个实验应在暗处进行。5）若样品中有β—胡萝卜素会干扰测定，应设法除去。6）三氯化锑腐蚀性强，要注意安全；仪器应先用盐酸浸泡后再清洗，以免产生沉淀。7）含量高的样品的提取。8）另两种显色剂三氟乙酸、三氯乙酸。

三）紫外分光光度法1、原理维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。2、适用范围及特点本法较比色法的灵敏度高，可测定维生素A含量低于5μg/g的样品。325nm处的干扰较多，故本法适用于透明鱼油，维生素A的浓缩物等纯度较高的样品。对一般的样品要经过多次去干扰醇化处理。3、测定方法样品处理……标准曲线绘制……样品测定……结果计算。

四）高效液相色谱法1、原理皂化、提取样品中的维生素A和维生素E后，用高效液相色谱法C18反相柱将两者分离，用紫外检测器检测，内标法定量。2、测定方法样品处理（皂化、提取、洗涤、浓缩）……标准曲线绘制……样品测定……结果计算。

二、β－胡萝卜素(β-carotene)的测定1、原理以丙酮和石油醚提取食物中的胡罗卜素(carotene)及其它植物色素，以石油醚作展开剂进行纸层析，剪下含胡罗卜素的区带，洗脱后于450nm波长下进行比色测定。2、测定步骤1）样品提取与洗涤a、粮食直接磨粉、果蔬等打成匀浆。取适量样品于100mL带塞的锥形瓶中，加20mL丙酮、5mL石油醚振摇1min，静置5min，提取液转入盛有100mL5％流酸钠溶液的分液漏斗中。同法提取2－3次,至提取液无色为止。提起液并入分液漏斗中，静置分层，弃下层水溶液，用15mL5％硫酸钠振荡洗涤数次，至水层不再混浊。

b、植物油和高脂肪样品：取1～10g样品，加乙醇30mL，1：1KOH10mL，加热回流30min，冰水中速冷，石油醚提取消化液，用水洗涤至中性。

2）浓缩与定容：

提取液经硫酸钠滤入250～300mL球形蒸发瓶内，10mL石油醚1次冲洗分液漏斗及硫酸钠，一并归入球形瓶中，回收石油醚，至2mL时，取下蒸发器，用氮气冲干，立即加入2mL石油醚定容。3）纸层析

点样——展开——洗脱4）比色测定5）标准曲线的绘制3、说明与讨论①此法为国家标准方法，简便、色带清晰，最小检出限为0.11ug。②提取样液要避光操作。③浓缩时要防止蒸干，而因氧化、高温紫外线直射等破坏，整个操作要迅速。④用氧化铝、氧化镁进行柱层析效果更好。⑤普通滤纸用于展开时，溶剂前沿距底部不得少于2cm。

三、维生素D(vitaminD,简称VD)的测定

（含抗佝偻病活性的一类物质）一）三氯化锑比色法1、原理：

在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与维生素D的含量成正比。2、

测定步骤1）样品处理：（皂化与提取同维生素A的测定，若样品中有维生素A共存用下法纯化）2）分离柱的制备：一支内径为2.0cm，具有活塞和砂芯板的玻璃层析柱中。第一层：1～2g无水硫酸钠，铺平整。第二层；15g白色硅藻土经石油醚、聚乙二醇处理，使其粘合均匀，倾入层析柱内。第三层：5g中性氧化铝。第四层：2～4g无水硫酸钠。轻轻转动层析柱，使第二层的高度保持在12cm左右。

3）纯化：用30～50mL石油醚淋洗分离柱——样品提取液倒入柱内——再用石油醚继续淋洗——弃最初收集的10mL滤液——余用200mL容量瓶收集淋洗液至刻度——500分液漏斗中100—150mL水洗涤3次——石油醚经无水硫酸钠脱水——水泵减压抽干或浓缩至干——立即加入5mL三氯甲烷溶液备用。

4）标准曲线的绘制5）样品测定6）结果计算3、

说明与讨论a、食品中维生素D的含量较低，故测定前必须经柱层析排除维生素A、E的干扰。b、操作时加入已酰氯可以消除温度的影响，使灵敏度提高3倍，还可减少部分甾醇的干扰。c、此法不能区分D2和D3，故测定值是两者的总量。二）、高压液相色谱法四、维生素E(vitaminE，简称VE)的测定

维生素E又称生育酚，属于酚类化合物，目前已确认有八种异构体：α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚。一）比色法原理：维生素E能将高铁离子还原为低铁离子，低铁离子与α，α/—联氮苯发生颜色反应，可以进行比色测定。

1、

测定步骤1）样品处理①皂化：用KOH甲醇溶液在氮气中72～74℃皂化10min——再在分液漏斗中用石油醚萃取——用水和氢氧化钾洗涤——无水硫酸钠脱水——在二氧化碳气体中减压蒸发至干——遂用5mL苯溶解。

②纯化：用分离柱，洗脱纯化。2）标准曲线的绘制3）样品测定4）结果计算2、说明与讨论①

维生素E在碱性条件下与空气接触易被空气氧化，因此在皂化时用氮气保护，或加入抗氧化剂保护。②应除去其它的还原物质，否则结果偏高。③用4，7—二苯基—1，10—菲绕啉作为发色剂其灵敏度高2.4倍。④维生素E的各种异构体与试剂的反应速度呈色强度各不相同。⑤广能促进维生素E氧化，应尽可能避光操作。第三章水溶性维生素的测定

维生素B1，B2，C广泛存在于动、植物组织中，其共性有：1、水溶性，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。2、在酸性介质中稳定。在碱介质中不稳定，易于分解。3、易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响（氧化分解）。一、维生素B1的测定维生素B1（vitaminB1,简称VB1），又名硫胺素，抗神经炎素，在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。1、原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，能被氧化为硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光。若不存在其它荧光物质干扰，荧光强度与硫色素含量成正比。2、操作方法1）样品提取（1）水解：称取匀浆或粉碎好的试样5～10g——于150mL三角瓶中。加入50～75mL、0.1mol或0.3mol盐酸——瓶上倒置小烧杯于高压锅中加热水解30min——冷却、滴加2mol乙酸钠，至pH为4.5。

（2）酶解：20g淀粉酶/1g试样——45～50℃温箱保温16小时——冷却至室温——定容至100mL——过滤即为提取液。2）净化

（过盐基交换柱分离净化）a、

将少许脱脂棉铺在交换柱底部，加水赶出汽泡。加1g左右活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度，保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。用移液管加入提取液20～80mL（使通过活性人造浮石的硫胺素总量为2～5µg）。加入10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液，如此重复三次。加入25%酸性氯化钾（温度为90˚c左右）20mL，收集此液于25mL刻度试管内，冷至室温，用25%酸性氯化钾定容，得试样净化液。b、将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换代替样品提取液，重复上述操作，得标准净化液。3）氧化将5mL试样净化液分别加入A(试样空白)、B（试样）两个Maizel－Gerson反应瓶。在避光环境中，A加3mL15%氢氧化钠溶液，振摇15秒后加入10mL正丁醇；B瓶加３mL碱性铁氰化钾溶液，振摇15秒后加入10mL正丁醇，同时用力振摇两个反应瓶，准确计时１５min。

用标准净化液代替试样净化液重复上述操作，得标准空白和标准液。用黑布遮盖各反应瓶，静止分层后弃去下层碱性溶液，加２～３g无水硫酸钠脱水。

４）、荧光强度的测定在激发波长３65nm；发射波长４３５nm；激发狭缝、发射狭缝各５nm条件下，依次测定试样空白、标准空白、试样、标样的荧光强度。

4、说明

（１）、一般食品中的维生素有游离型的，也有结合型的，即与淀粉、蛋白质等结合再一起的，故需用酸和酶水解，使结合型B1成为游离型，再采用此法测定。

（２）、可在加入酸性氯化钾后停止实验，因为硫胺素在此溶液中比较稳定。

（３）、样品与铁氰化钠溶液混合后，所呈现的黄色应至少保持１５秒，否则应在滴加铁氰化钾溶液１～２滴。因为样品中如含有还原性物质，而铁氰化钾用量不够时，硫胺素氧化不完全，给结果带来误差。但过多的铁氰化钾回破坏硫色素，故其用量应恰当控制。（４）、硫色素能溶于正丁醇，在正丁醇中比在水中稳定，故用正丁醇等提取硫色素。萃取时振摇不宜过猛，以免乳化，不易分层。

（５）、紫外线破坏硫色素，所以硫色素形成后要迅速测定，并力求避光操作。

（６）、用甘油－淀粉润滑剂代替凡士林涂盐基交换管下活塞，因凡士林具有荧光。

（７）、谷类物质不需酶分解，样品粉碎后用２５%酸性氯化钾直接提取，氧化测定。

（８）、氧化是操作的关键步骤，操作中应保持试剂的迅速一致。三、维生素(VC)的测定

二）2，4－二硝基苯肼比色法1、原理

用活性炭将还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，然后与2，4－二硝基苯肼作用生成红色的脎。在浓硫酸的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物——双－2，4－二硝基苯。在硫酸溶液中显色稳定，最大吸收波长为520nm，吸光度与总抗坏血酸含量成正比，可进行比色测定。

2、试剂配置及处理3、测定步骤①样品提取：同上法。②氧化：取25mL样品滤液，加2g活性炭振摇1