NSFC一个新的调控肿瘤血管生成的候选分子-Rac1及其作用机制的研究

2003中标申请代码：C03020303：题目：一个新的调控肿瘤血管生成的候选分子－Rac12003中标申请代码：C03020303：题目：一个新的调控肿瘤血管生成的候选分子－Rac1及其作用机制的研究项目的立项依据（附主要的参考文献目录）研究意义：血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的基础，肿瘤血管生成是一个非常复杂的过程，受多种分子的调节，尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，诸多血管生成调节因子的上游调控机制并未完全阐明；其次，内皮细胞和肿瘤细胞分别通过自分泌和旁分泌途径来调节血管生成，哪些分子能同时调节并协调这两条途径呢？我们的工作基础和文献研究表明Rac1可能正是解决这两方面不足的关键分子。Rac1属于RhoGTPases家族，在肿瘤的发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要作用。一方面，我们的研究表明，在缺氧情况下，多种肿瘤细胞中Rac1mRNA和活性水平较正常明显增高，4h达到高峰，可持续至16h后表达水平逐渐降低，且其活性高低与HIF-1α、VEGF、p53表达水平呈正相关；而应用负显性的Rac1可显著减弱VEGF的表达。由于VEGF是参与肿瘤血管生成的一个主要分子，这就提示我们，抑制项目的立项依据（附主要的参考文献目录）研究意义：血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的基础，肿瘤血管生成是一个非常复杂的过程，受多种分子的调节，尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，诸多血管生成调节因子的上游调控机制并未完全阐明；其次，内皮细胞和肿瘤细胞分别通过自分泌和旁分泌途径来调节血管生成，哪些分子能同时调节并协调这两条途径呢？我们的工作基础和文献研究表明Rac1可能正是解决这两方面不足的关键分子。Rac1属于RhoGTPases家族，在肿瘤的发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要作用。一方面，我们的研究表明，在缺氧情况下，多种肿瘤细胞中Rac1mRNA和活性水平较正常明显增高，4h达到高峰，可持续至16h后表达水平逐渐降低，且其活性高低与HIF-1α、VEGF、p53表达水平呈正相关；而应用负显性的Rac1可显著减弱VEGF的表达。由于VEGF是参与肿瘤血管生成的一个主要分子，这就提示我们，抑制Rac1可能直接抑制肿瘤血管生成。另有其它研究也同样表明Rac1参与缺氧情况下HIF-1（缺氧诱导因子1）的活化，促进HIF-1的转录活性和蛋白表达。HIF-1是肿瘤生长过程中的一个重要调节因子，活化的HIF-1可促进许多与血管生成相关的基因的转录，如VEGF、VEGFR、FGF、TGF、Cox2和NOS，从而维持肿瘤细胞能量代谢，促进肿瘤的增殖和转移。另一方面，Rac1可调节ECM（细胞外基质）和VEGF（血管内皮细胞生长因子）诱导的内皮细胞的趋触和趋化作用，促进内皮细胞的增殖、运动和迁移，是VEGFR(VEGF受体)后信号通路的一个重要中间分子。此外，许多药物及分子，如磷酸鞘氨醇、组织因子、非甾体类抗炎药、斯伐他仃和活性氧簇等都通过Rac1调节内皮细胞运动。因此，Rac1可能是血管生成过程中的一个关键调控因子。为证明这一设想，本研究拟利用RNAi和蛋白质双向电泳技术探讨Rac1对肿瘤血管生成的调控作用及可能的调控机制，为进一步阐明Rac1的生理病理作用、深入理解肿瘤血管生成的机制及开发新型的血管生成抑制剂奠定一定的理论基础。国内外研究现状及分析1．血管生成是肿瘤生长、侵袭转移和复发的基础肿瘤血管生成是肿瘤迅速增殖的前提条件[1]。原位肿瘤细胞在肿瘤发生的初期通过组织间液获取从毛细血管渗透的营养物质，排泄代谢产物，并进行氧气交换。由于细胞增殖缓慢且数目有限，局部组织间液足以支持肿瘤细胞的生长，这种状态可维持相当长的时间，称为血管前期。在无自身血供的条件下，肿瘤的体积几乎不超过1～2mm3。随着肿瘤细胞的不断增殖，仅通过渗透过程已不能满足细胞生长的需要，瘤体组织的微环境出现缺氧、代谢产物堆积、PH值改变等。这些因素刺激肿瘤细胞、周围的间质细胞和淋巴细胞分泌血管生长刺激因子，同时抑制血管生长抑制因子产生，打破二者在肿瘤组织局部的平衡，诱导血管基底膜降解和内皮细胞增殖，启动血管生成[2]。肿瘤血管内皮细胞的分裂速度比正常血管内皮细胞快得多，所生成的血管生长因子也可通过自分泌和旁分泌形式参与血管生成的调节。肿瘤侵袭转移在两个阶段依赖血管生成：第一，在原发肿瘤出现新生血管之前，肿瘤细胞一般不会从原发灶脱落，而原发肿瘤的血管组织越丰富，肿瘤细胞转移的机会就越大。新生的肿瘤血管基底膜和细胞连接较少，血管通透性高，是肿瘤细胞转移的门户和路径。第二，转移的瘤细胞在到达目的器官后必须重新经历新血管生成过程，否则转移的细胞只能在它们渗出循环的微血管周围形成显微水平的血管前期袖状结构[3-4]。肿瘤血管生成还与肿瘤的预后密切相关，通过组织形态学、免疫组化、生物化学和影像学等测定肿瘤组织的血管密度和血管生长因子水平及血清中血管生长因子水平可知，血管生成是多种肿瘤复发、转移和预后的判断标准[5]，例如浸润性乳腺管癌、早期胃癌、肺腺癌等。2．肿瘤血管生成是诸多因素共同作用的结果血管生成是多因素作用的结果，其中血管生长刺激因子和血管生长抑制因子直接地影响血管内皮细胞和基质细胞，二者之间的平衡决定了促进或阻止血管生成。微环境的供血不足会造成局部组织缺氧，从而诱导血管内皮细胞、基质细胞、肿瘤细胞生成血管生长刺激因子和抑制因子，通过自分泌或旁分泌的形式发挥作用，并且某些因子还可进入血液循环，作用于远端组织。血管生长刺激因子不仅能够刺激血管内皮细胞增殖、迁移、基质蛋白裂解和形成毛细血管结构，而且也可作用于血管周围基质细胞和血管壁的平滑肌细胞，诱导其增殖和分泌等。目前已确定出十几种血管生长刺激因子，包括VEGF家族、EGF/TGF-α、FGF家族、TNF-α、IL-8、血管生成素angiogenin等。在正常生理条件下，血管生长抑制因子可维持血管内皮细胞的相对静止状态，防止血管过度增生，与血管生长刺激因子一起构成复杂而精确的调节血管前期。在无自身血供的条件下，肿瘤的体积几乎不超过1～2mm3。随着肿瘤细胞的不断增殖，仅通过渗透过程已不能满足细胞生长的需要，瘤体组织的微环境出现缺氧、代谢产物堆积、PH值改变等。这些因素刺激肿瘤细胞、周围的间质细胞和淋巴细胞分泌血管生长刺激因子，同时抑制血管生长抑制因子产生，打破二者在肿瘤组织局部的平衡，诱导血管基底膜降解和内皮细胞增殖，启动血管生成[2]。肿瘤血管内皮细胞的分裂速度比正常血管内皮细胞快得多，所生成的血管生长因子也可通过自分泌和旁分泌形式参与血管生成的调节。肿瘤侵袭转移在两个阶段依赖血管生成：第一，在原发肿瘤出现新生血管之前，肿瘤细胞一般不会从原发灶脱落，而原发肿瘤的血管组织越丰富，肿瘤细胞转移的机会就越大。新生的肿瘤血管基底膜和细胞连接较少，血管通透性高，是肿瘤细胞转移的门户和路径。第二，转移的瘤细胞在到达目的器官后必须重新经历新血管生成过程，否则转移的细胞只能在它们渗出循环的微血管周围形成显微水平的血管前期袖状结构[3-4]。肿瘤血管生成还与肿瘤的预后密切相关，通过组织形态学、免疫组化、生物化学和影像学等测定肿瘤组织的血管密度和血管生长因子水平及血清中血管生长因子水平可知，血管生成是多种肿瘤复发、转移和预后的判断标准[5]，例如浸润性乳腺管癌、早期胃癌、肺腺癌等。2．肿瘤血管生成是诸多因素共同作用的结果血管生成是多因素作用的结果，其中血管生长刺激因子和血管生长抑制因子直接地影响血管内皮细胞和基质细胞，二者之间的平衡决定了促进或阻止血管生成。微环境的供血不足会造成局部组织缺氧，从而诱导血管内皮细胞、基质细胞、肿瘤细胞生成血管生长刺激因子和抑制因子，通过自分泌或旁分泌的形式发挥作用，并且某些因子还可进入血液循环，作用于远端组织。血管生长刺激因子不仅能够刺激血管内皮细胞增殖、迁移、基质蛋白裂解和形成毛细血管结构，而且也可作用于血管周围基质细胞和血管壁的平滑肌细胞，诱导其增殖和分泌等。目前已确定出十几种血管生长刺激因子，包括VEGF家族、EGF/TGF-α、FGF家族、TNF-α、IL-8、血管生成素angiogenin等。在正常生理条件下，血管生长抑制因子可维持血管内皮细胞的相对静止状态，防止血管过度增生，与血管生长刺激因子一起构成复杂而精确的调节网络。血管生长抑制因子参与血管生成的各个步骤，既可直接抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，阻碍胞外基质降解，也可通过抑制刺激因子的表达，拮抗其功能，间接抑制血管生成。如肿瘤细胞、肿瘤浸润细胞（单核细胞、巨噬细胞）、肿瘤血管内皮细胞和基质细胞等分泌的血管生长因子通过自分泌或旁分泌等途径发挥作用。激活的单核细胞/巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1，刺激黑色素瘤细胞分泌IL-8和VEGF，都可促进肿瘤血管生成。表1血管生长调节因子除了血管生长因子及抑制因子外，肿瘤血管生成还受癌基因、化合物、激素和酶等多种因素的影响。肿瘤相关基因表达异常能够导致旁分泌的血管生长因子水平改变，如ras突变可明显诱导VEGF的表达；在慢性胰腺炎和胰腺癌中，K-ras基因突变与血管生成的增加密切相关，可能促进肿瘤血管生成[6]。癌基因c-met参与多种肿瘤的发生和发展，与肿瘤的预后密切相关，其基因产物是血管刺激因子HGF的受体，作为一种跨膜酪氨酸激酶，参与肿瘤血管生长调节[7]。肿瘤细胞中p53突变或缺失则导致HIF-1α增加和VEGF转录增强，间接刺激肿瘤血管生成[8]。此外，多种化合物和激素，如TNP-470烟曲霉素类似物、NAC、一些类固醇类激素可抑制血管内皮细胞的运动和血管生成；而金属蛋白酶（MMPs）还可通过降解基质促进肿瘤的血管生成和细胞转移。3．目前在肿瘤血管生成研究方面存在的不足之处尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，目前一些针对上述单个因子或多个因子的治疗并未取得较佳的疗效，是什么原因呢？我们知道，肿瘤的发生是一个多基因参与的复杂过程，与正常细胞相比，肿瘤细胞的表达谱紊乱，表现为多种分子表达失调。同样，在肿瘤的血管生成过程中，单分子的作用是非常微弱的，只有多种分子共同作用才能最终导致血管生成。那么，这诸多分子的上游机制是什么？有没有一个能调控多种肿瘤血管生成相关因素的分子？如果能找到一个能有效调节并协调多种因素的分子，也许将为肿瘤血管生成的相关研究开辟新的领域。其次，有关肿瘤血管生成方面的研究或者针对肿瘤细胞，或者针对内皮细胞，而未将两者有机地结合起来。肿瘤细胞和内皮细胞可通过旁分泌和自分泌两条途径共同促进肿瘤血管生成，有无关键性的分子可同时调节这两条途径呢？这些问题都有待进一步的研究来血管生长刺激因子血管生长抑制因子VEGFEndostatinbFGFaFGFAngostatinTGF-αEGFIL-1G-CSFIL-12HGFIP-10IL-8SDF-1Platelet-activatingfactorTSP-1PLGFIFNα,β,γProliferinTIMPs1,2,3,4PDEGF/ThymidineporylasePF4B6116KprolactinfragmentE-selectinProliferinrelatedproteinAngiogeninProfactinfragmentAngiotropinProtamine表1血管生长调节因子除了血管生长因子及抑制因子外，肿瘤血管生成还受癌基因、化合物、激素和酶等多种因素的影响。肿瘤相关基因表达异常能够导致旁分泌的血管生长因子水平改变，如ras突变可明显诱导VEGF的表达；在慢性胰腺炎和胰腺癌中，K-ras基因突变与血管生成的增加密切相关，可能促进肿瘤血管生成[6]。癌基因c-met参与多种肿瘤的发生和发展，与肿瘤的预后密切相关，其基因产物是血管刺激因子HGF的受体，作为一种跨膜酪氨酸激酶，参与肿瘤血管生长调节[7]。肿瘤细胞中p53突变或缺失则导致HIF-1α增加和VEGF转录增强，间接刺激肿瘤血管生成[8]。此外，多种化合物和激素，如TNP-470烟曲霉素类似物、NAC、一些类固醇类激素可抑制血管内皮细胞的运动和血管生成；而金属蛋白酶（MMPs）还可通过降解基质促进肿瘤的血管生成和细胞转移。3．目前在肿瘤血管生成研究方面存在的不足之处尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，目前一些针对上述单个因子或多个因子的治疗并未取得较佳的疗效，是什么原因呢？我们知道，肿瘤的发生是一个多基因参与的复杂过程，与正常细胞相比，肿瘤细胞的表达谱紊乱，表现为多种分子表达失调。同样，在肿瘤的血管生成过程中，单分子的作用是非常微弱的，只有多种分子共同作用才能最终导致血管生成。那么，这诸多分子的上游机制是什么？有没有一个能调控多种肿瘤血管生成相关因素的分子？如果能找到一个能有效调节并协调多种因素的分子，也许将为肿瘤血管生成的相关研究开辟新的领域。其次，有关肿瘤血管生成方面的研究或者针对肿瘤细胞，或者针对内皮细胞，而未将两者有机地结合起来。肿瘤细胞和内皮细胞可通过旁分泌和自分泌两条途径共同促进肿瘤血管生成，有无关键性的分子可同时调节这两条途径呢？这些问题都有待进一步的研究来血管生长刺激因子血管生长抑制因子VEGFEndostatinbFGFaFGFAngostatinTGF-αEGFIL-1G-CSFIL-12HGFIP-10IL-8SDF-1Platelet-activatingfactorTSP-1PLGFIFNα,β,γProliferinTIMPs1,2,3,4PDEGF/ThymidineporylasePF4B6116KprolactinfragmentE-selectinProliferinrelatedproteinAngiogeninProfactinfragmentAngiotropinProtamineAngiopoetinTGFβTNFαTNFαTGFαTGFβThrombospondinSubstancePMinocyclineProstaglandinE1/E22-methoxycestrandolFASligandPetinoicacid解答。目前的文献和我们的工作基础表明Rac1可能正是解决这两方面不足的关键分子。4．Rac1可能是调控肿瘤血管生成的核心分子4．1Rac1与肿瘤Rac1全称为Ras相关的C3肉毒毒素底物1（ras-relatedC3botulinumtoxinsubstrate1），属于Rho-GTP酶家族。Rho-GTP酶是小GTPases家族的成员之一，是一组分子质量约20～25kDa的单体鸟苷酸结合蛋白，其活性受GDP/GTP循环调节。Rho蛋白与GDP结合时处解答。目前的文献和我们的工作基础表明Rac1可能正是解决这两方面不足的关键分子。4．Rac1可能是调控肿瘤血管生成的核心分子4．1Rac1与肿瘤Rac1全称为Ras相关的C3肉毒毒素底物1（ras-relatedC3botulinumtoxinsubstrate1），属于Rho-GTP酶家族。Rho-GTP酶是小GTPases家族的成员之一，是一组分子质量约20～25kDa的单体鸟苷酸结合蛋白，其活性受GDP/GTP循环调节。Rho蛋白与GDP结合时处于非活性状态，在鸟苷酸交换因子（guaninenucleotideexchangefactor，GEF）或GDP解离刺激因子（GDPdissociationstimulator，GDS）作用下释放GDP，遂结合GTP成为活性蛋白。活化的Rho蛋白作用于胞浆中多种信号分子，调节细胞内信号的传递。同时，Rho蛋白的GTP酶活性可以将GTP转变为GDP，继使Rho蛋白灭活。GTP酶激活蛋白（GAP）可以诱导Rho蛋白的GTP酶活性，促进Rho蛋白的灭活。另外GDP解离抑制剂（GDPdissociationinhibitor，GDI）可将胞浆内GDP结合形式的Rho蛋白从GTP-GDP循环中分离出来，从而抑制Rho蛋白的活性。Rac1基因全长29kb，定位于7p22，与人类Rho及Ras基因具有58%及30%的氨基酸同源性。Rac1位于细胞膜内，广泛表达于多种组织，尤以心脏、肾脏及胰腺表达水平高，是一典型的看家基因[9]。目前的研究表明，Rac1在肿瘤发生、侵袭和转移、细胞周期调控及凋亡过程中发挥着重要的作用。Rac1参与Ras对纤维母细胞的转化能力[10]，其功能失调可促进侵袭性肿瘤中上皮向间质的转换，并导致细胞粘附连接功能的丧失[11]。Rac1还可通过调节细胞外基质蛋白、基质金属蛋白酶(MMPs)或其拮抗剂(TIMPs)的水平来调节ECM的降解和重组[12]，从而促进肿瘤的侵袭和转移。此外，Rac1还通过上调CyclinD1和释放活性氧参与细胞周期的调控和凋亡过程。Rac1b是Rac1的变异剪接体，主要在肠道上皮组织和皮肤表达，在不同进展阶段的结直肠癌中，Rac1b表达水平明显上升，提示Rac1b参与肠道上皮正常和恶性生长[13]。另有研究者在乳腺癌组织中也鉴定出了Rac1b，认为Rac1b是作为一种快速循环的GTP酶来发挥作用的[14]。目前关于Rac1b和肿瘤的研究非常少，仅明确其可能参与乳腺癌和结直肠癌的发生、发展。由于Rac1b主要是作为一种快速循环的GTP酶来发挥作用，而目前国际上认为这种形式可能比活性形式更有效，因此，对于Rac1b与肿瘤的研究可能具有很好的前景。4．2Rac1参与肿瘤血管生成在血管生成中，内皮细胞在趋化因子的作用下开始运动，因此明确内皮细胞的运动机制对控制血管生成及预防肿瘤非常重要。VEGF可有效地趋化内皮细胞运动，但内皮细胞中与细胞周期的调控和凋亡过程。Rac1b是Rac1的变异剪接体，主要在肠道上皮组织和皮肤表达，在不同进展阶段的结直肠癌中，Rac1b表达水平明显上升，提示Rac1b参与肠道上皮正常和恶性生长[13]。另有研究者在乳腺癌组织中也鉴定出了Rac1b，认为Rac1b是作为一种快速循环的GTP酶来发挥作用的[14]。目前关于Rac1b和肿瘤的研究非常少，仅明确其可能参与乳腺癌和结直肠癌的发生、发展。由于Rac1b主要是作为一种快速循环的GTP酶来发挥作用，而目前国际上认为这种形式可能比活性形式更有效，因此，对于Rac1b与肿瘤的研究可能具有很好的前景。4．2Rac1参与肿瘤血管生成在血管生成中，内皮细胞在趋化因子的作用下开始运动，因此明确内皮细胞的运动机制对控制血管生成及预防肿瘤非常重要。VEGF可有效地趋化内皮细胞运动，但内皮细胞中VEGFR后的信号传导通路尚不明。目前研究表明，在VEGF刺激的内皮细胞趋化过程中，需要Rac1的活化[15]；而在Ⅰ型胶原诱导的趋触作用中，Rac1同样被激活。与VEGF类似，Rac1激活后可增加内皮细胞内片状伪足和膜皱褶水平，从而促进内皮细胞的迁移和运动。这些结果表明，Rac1参与VEGFR后的信号传导通路，其活性对于内皮细胞的运动和迁移是必需的。缺氧（hypoxia）是实体肿瘤组织内的重要现象。认为，缺氧环境中的肿瘤细胞增强了缺氧诱导因子1（hypoxiainduciblefactor1，HIF-1）的表达和活性。HIF-1是一种缺氧活化的转录因子，它可以调节多种缺氧应激蛋白的基因表达，增强肿瘤细胞的无氧酵解能力，上调多种促血管生成因子的表达，如p53、VEGF、COX-2和NFκ-B依赖的诱导型NO合成酶[16]。有人研究了缺氧条件下Rac1对HIF-1的影响，发现负显性的Rac1可抑制HIF-1基因转录、反式激活结构域功能及蛋白表达，而正显性的Rac1可增强上述作用[17]。结果表明，Rac1对于HIF-1的激活是必需的，如果抑制了Rac1的功能，可能会抑制许多与血管生成相关的基因的转录与激活。我们的研究也表明，在缺氧情况下，多种肿瘤细胞中Rac1mRNA和活性水平较正常明显增高，4h达到高峰，可持续至16h后表达水平逐渐降低，且其活性高低与HIF-1α、VEGF、p53表达水平呈正相关；而应用负显性的Rac1可显著减弱VEGF的表达。由于VEGF是参与肿瘤血管生成的一个主要分子，这就提示我们，抑制Rac1可能直接抑制肿瘤血管生成。此外，许多药物及分子，如磷酸鞘氨醇、组织因子、非甾体类抗炎药、斯伐他仃和活性氧簇等都通过Rac1调节内皮细胞运动并进而影响血管生成。因此，Rac1可能是血管生成信号通路中的一个核心分子。2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题：研究内容：一、Rac1与肿瘤血管生成的相关性研究1．Rac1与临床肿瘤标本血管生成相关性的研究：收集临床肿瘤石蜡包埋切片，常规采用S-P法进行免疫组化染色，分别检测癌区、癌旁区和切缘区组织微血管密度及数目和Rac1表达状况，分析两者表达状况的相关性。2．Rac1与不同胃癌细胞系诱生血管生成能力的相关性研究：利用Westernblot及pulldownassay检测不同胃癌细胞系（SGC-7901,AGS,KATOⅢ,MKN-28,MKN-45,9811等）Rac1的表达状况及活性；同时将上述胃癌细胞接种裸鼠，瘤块切片，免疫组化检测微血管密度和数目，观察与Rac1表达状况的相关性。二、Rac1对肿瘤细胞诱生血管生成能力的影响及相关分子机制研究1．制备胃癌细胞株（Rac1不同表达状况）：利用脂质体介导的转染技术制备2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题：研究内容：一、Rac1与肿瘤血管生成的相关性研究1．Rac1与临床肿瘤标本血管生成相关性的研究：收集临床肿瘤石蜡包埋切片，常规采用S-P法进行免疫组化染色，分别检测癌区、癌旁区和切缘区组织微血管密度及数目和Rac1表达状况，分析两者表达状况的相关性。2．Rac1与不同胃癌细胞系诱生血管生成能力的相关性研究：利用Westernblot及pulldownassay检测不同胃癌细胞系（SGC-7901,AGS,KATOⅢ,MKN-28,MKN-45,9811等）Rac1的表达状况及活性；同时将上述胃癌细胞接种裸鼠，瘤块切片，免疫组化检测微血管密度和数目，观察与Rac1表达状况的相关性。二、Rac1对肿瘤细胞诱生血管生成能力的影响及相关分子机制研究1．制备胃癌细胞株（Rac1不同表达状况）：利用脂质体介导的转染技术制备Rac1、Rac1b不同表达状况的SGC-7901细胞亚系：高表达（转染正显性的Rac1）、低表达（转染负显性Rac1或Rac1、Rac1b的siRNA）。设计3个针对Rac1、Rac1bmRNA的siRNAs，合成其相应具有Bbs1和Xba1酶切位点的DNA正反义链，退火后克隆入mU6pro载体，对重组克隆进行酶切及测序鉴定，与含有neo基因的pcDNA3.1共转染SGC7901细胞，同时转染正显性和负显性Rac1，G418筛选单克隆；以空载体转染细胞系为对照。用RT-PCR、Westernblot及pull-downassay检测转染效应。2．Rac1高/低表达对胃癌细胞诱生血管能力的影响：①体外血管形成能力：用高/低表达Rac1的SGC7901细胞培养上清处理人脐静脉内皮细胞，应用化学粘附、运动和增殖试验观察对其运动、增殖和粘附能力的影响，利用tubeformationassay观察体外血管形成能力。②体内血管形成能力：利用CAMassay及MouseMartrigelplugassay观测体内血管形成能力；同时分别将高/低表达Rac1的SGC7901细胞接种裸鼠，建立体内肿瘤模型，观察瘤块大小、动物生存期，及用免疫组化检测瘤块内微血管密度和数目及VEGF、HIF、P53等分子表达水平的变化。3．Rac1诱导肿瘤血管生成的相关分子机制研究收集转染与未转染Rac1、Rac1bsiRNA的SGC-7901细胞培养上清，浓缩后用于双向电泳，凝胶银染法显示其蛋白质的差异表达，进而用Westernblot及质谱测序鉴定这些差异表达蛋白，从中筛选出与血管生成相关的分子。三、Rac1对内皮细胞诱生血管能力的影响及相关分子机制研究应用一定的刺激因素（肿瘤细胞培养上清、VEGF、ECM）处理高表达（转染正显性的Rac1）、低表达（转染负显性Rac1或Rac1、Rac1b的siRNA）Rac1的内皮细胞，以未转染细胞为对照，观察内皮细胞增殖、运动能力的变化；同时应用激光共聚焦显微镜观察内皮细胞细胞骨架的变化；收集转染与未转染内皮细胞的培养上清，浓缩后用于双向电泳，凝胶银染法显示其蛋白质的差异表达，进而用Westernblot及质谱测序鉴定这些差异表达蛋白，从中筛选出与血管生成相关的分子。研究目标：借助哺乳动物细胞siRNA及高通量蛋白质鉴定技术研究Rho蛋白家族分子Rac1对肿瘤血管生成的调控作用，以期深入理解肿瘤血管生成的分子机制及Rac1在其中的作用，最终为阐明三、Rac1对内皮细胞诱生血管能力的影响及相关分子机制研究应用一定的刺激因素（肿瘤细胞培养上清、VEGF、ECM）处理高表达（转染正显性的Rac1）、低表达（转染负显性Rac1或Rac1、Rac1b的siRNA）Rac1的内皮细胞，以未转染细胞为对照，观察内皮细胞增殖、运动能力的变化；同时应用激光共聚焦显微镜观察内皮细胞细胞骨架的变化；收集转染与未转染内皮细胞的培养上清，浓缩后用于双向电泳，凝胶银染法显示其蛋白质的差异表达，进而用Westernblot及质谱测序鉴定这些差异表达蛋白，从中筛选出与血管生成相关的分子。研究目标：借助哺乳动物细胞siRNA及高通量蛋白质鉴定技术研究Rho蛋白家族分子Rac1对肿瘤血管生成的调控作用，以期深入理解肿瘤血管生成的分子机制及Rac1在其中的作用，最终为阐明Rac1的生理病理作用，为肿瘤血管基因治疗开拓新的靶点奠定一定的理论基础。技术难题及解决方法：1．有效的RNAi：设计针对多个不同位点的RNAi，挑选出最佳作用者。本实验针对Rac1的不同位点设计了2个RNAi，针对Rac1b设计了1个RNAi。本课题组成员毕锋教授过去一直从事核酶及反义核酸对肿瘤基因治疗的相关研究，在反义核酸、核酶设计及实际应用方面具有丰富的经验；又到美国Tennessee大学留学3年，在《Cancergenether》、《Molcellbiol》和《JBiolChem》等杂志上已发表多篇有关基因治疗及Rho蛋白与肿瘤关系的研究论文，回国后组建Rho蛋白研究课题组，利用RNAi技术成功地阻断了RhoA、RhoC的表达，积累了丰富的RNAi设计及应用经验。申请者和课题组成员目前一直从事Rho蛋白的RNAi及反义核酸、核酶逆转肿瘤恶性表型的研究工作，能熟练地设计作用位点和应用基因扩增、重组和转染等技术，为完成本课题奠定了扎实的理论基础、积累了丰富的操作经验。2．条件培养基内差异表达分子的筛选：本课题组成员王新和时永全讲师近5年一直从事胃癌耐药相关蛋白质分子的差异显示相关研究，已经成功地建立并优化了蛋白组学分析中的双向电泳技术—O′Farrell双向电泳系统和IPG-等电聚焦双向电泳系统，并应用此双向电泳技术比较胃癌SGC7901细胞和其长春新硷耐药亚系SGC7901/VCR细胞蛋白质组的差异。筛选出了30种明显差异表达的蛋白质，并初步确定了其等电点和分子量。同时，本单位具备先进的双向电泳相关的整套设备，能够支持本研究工作的进行，并可与军科院放射技术研究所（有高通量蛋白质鉴定技术）协作，这将是我们成功完成本课题的保证。3拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方法：Westernblot，Northernblot，tubeformationassay，Chorioallantoicmembrane(CAM)assay，MouseMatrigelplugassay，半定量RT-PCR，Pull-downassay，基因转染，免疫组化，化学运动、化学侵袭及细胞粘附实验，体内肿瘤形成实验，蛋白质双向电泳，RNAi技术。本课题技术路线1：技术研究所（有高通量蛋白质鉴定技术）协作，这将是我们成功完成本课题的保证。3拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方法：Westernblot，Northernblot，tubeformationassay，Chorioallantoicmembrane(CAM)assay，MouseMatrigelplugassay，半定量RT-PCR，Pull-downassay，基因转染，免疫组化，化学运动、化学侵袭及细胞粘附实验，体内肿瘤形成实验，蛋白质双向电泳，RNAi技术。本课题技术路线1：本课题技术路线2：（转染细胞换为肿瘤细胞）本课题技术路线2：（转染细胞换为肿瘤细胞）实验方案：

实验方案：Rac1、Rac1bsiRNA的构建：1．siRNA表达载体mU6pro为美国密西根大学TurnerDL教授惠赠（PNAS，2002，99；6047－52）。该载体含有RNAU6启动子。2．在Rac1、Rac1b编码序列中选择3－5段19nt的寡核苷酸，符合以下要求①经BLAST数据库分析，无同源序列；②G+C含量接近50％；③不含TTT或GGG序列。3．依据siRNA表达载体mU6pro的要求，合成3－5对含有上述19nt的寡核苷酸的引物。每一引物内，19ntRac1、Rac1bsiRNA的构建：1．siRNA表达载体mU6pro为美国密西根大学TurnerDL教授惠赠（PNAS，2002，99；6047－52）。该载体含有RNAU6启动子。2．在Rac1、Rac1b编码序列中选择3－5段19nt的寡核苷酸，符合以下要求①经BLAST数据库分析，无同源序列；②G+C含量接近50％；③不含TTT或GGG序列。3．依据siRNA表达载体mU6pro的要求，合成3－5对含有上述19nt的寡核苷酸的引物。每一引物内，19nt的寡核苷酸以正反向组合，中间以aca/tgt间隔，使引物内部可形成发夹结构。另一引物的核心序列与其反向互补。每对引物两端分别带有Bbs1和Xba1酶切位点:例如：正向:5’-tttggacagaagtgcttcacctacaaggtgaagcacttctgtccttttt-3’反向:5’-ctagaaaaaggacagaagtgcttcaccttgtaggtgaagcacttctgtc-3’4．合成双链寡核苷酸取20ul正反义寡核苷酸(终浓度均为100nmoles/ml),5ul10×退火缓冲液（1MNaCl,100mMTris,pH7.4）,加入5ul去离子水置于95℃水浴锅使其自然冷却至室温.3连接用0.5×退火缓冲液以1：4000稀释双链寡核苷酸,取1ul稀释液，9ulmU6pro载体（30-50ng）在室温下连接30分钟。5．转化将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，于氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体。6．重组克隆的酶切鉴定与DNA测序扩增白色抗性菌落并提取质粒，经Bbs1和Xba1酶切有片段释放即为重组克隆，进行DNA测序。基因转染：1．按5×105细胞/孔的量在六孔板中接种指数期生长的细胞，在37℃5％CO培养箱中培养2过夜，直至细胞80%汇合。2．在聚苯乙烯管中配置DNA/脂质体复合物如下：稀释DNA至1mlDMEM-SF中，在旋涡混合器上振荡1s，然后加入脂质体悬液，再次悬起混匀。在室温下温育5～10min，使DNA与阳离子脂质体结合。3．吸去DMEM-10培养液，用1ml的完全的DMEM-SF洗1次，吸去DMEM-SF。对每个35mm孔中，直接在细胞上加1mlDNA/脂质体复合物。在37℃5％CO2培养箱中温育3～5h。4．往每孔细胞中加入1mlDMEM-20完全培养液。在37℃5％CO培养箱中继续温育24～48h。25．吸去完全DMEM/DNA/脂质体复合物，每孔加入2ml新的DMEM-10完全培养液，继续温育24～48h。6．收集细胞：用细胞刮子刮下细胞，进行适当的表达分析。Northern印迹分析1．取胃癌细胞总RNA，经甲醛变性胶电泳分离。2．核酸真空转移装置将RNA转移到NC膜上，并于80℃烘烤2h固定RNA。3．利用试剂盒将32P标记在Rac1cDNA片段上制备探针。4．预杂交：将携带质粒DNA样品的NC膜封于含足量预杂交液（50%去离子甲酰胺、5×SSC、2×Dendhart、0.1%SDS、100g/mL鲑鱼精DNA）的塑料袋中，于42℃平缓摇转（100rpm/min）4-6h；Northern印迹分析1．取胃癌细胞总RNA，经甲醛变性胶电泳分离。2．核酸真空转移装置将RNA转移到NC膜上，并于80℃烘烤2h固定RNA。3．利用试剂盒将32P标记在Rac1cDNA片段上制备探针。4．预杂交：将携带质粒DNA样品的NC膜封于含足量预杂交液（50%去离子甲酰胺、5×SSC、2×Dendhart、0.1%SDS、100g/mL鲑鱼精DNA）的塑料袋中，于42℃平缓摇转（100rpm/min）4-6h；5．杂交：将反转录法制备的单链cDNA探针加入预杂交液中（液体用量按照每平方厘米取出NC膜，依次进行低、中、高严谨度洗膜；用滤纸吸干NC膜，置暗盒中，于-70℃对X光片进行放射自显影72h。Westernblot检测蛋白水平:1．双向电泳凝胶或SDS凝胶经转移缓冲液（25mmol/LTris碱、192mmol/L甘氨酸、20%甲醇）浸泡10-20min。2．按照多孔垫料、3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸、多孔垫料的顺序组装盒式转移塔，并将其以NC膜向阳极的方向装入转移装置。3．于4℃持续搅拌条件下，恒流电转移1～2h。4．用丽春红染液对滤膜进行染色，标记笔标记蛋白分子量标准各条带所在位置，再用去离子水洗去丽春红。5．滤膜经5%脱脂奶粉于室温封闭1h；与稀释于5%脱脂奶粉的一抗于4℃孵育过夜，TBST（10mmol/LTris碱、150mmol/L氯化钠、0.05%Tween20、pH8.0）摇洗4次×15min。6．与稀释于5%脱脂奶粉的HRP标记的山羊抗小鼠IgG于室温孵育1.5h，TBST摇洗4次×15min。7．以ECL进行显色。Pull-downassay1.GST-PAK融合蛋白的制备：谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白表达于大肠杆菌BL-21株，将100ml饱和过夜菌接种于1LLB培养基中，培养1小时，加入IPTG至0.2mM，诱导3小时。离心收获细胞，重悬于50ml低盐结合缓冲液(LSAB,100mMTris-HCl,pH8.0,100mMNaCl,1%NP-40,1mMPMSF,0.03%SDS,2mMDTT)中，超声裂解后，10,000g离心10min，取上清与谷胱甘肽琼脂糖小珠(glutathionesepharosebeads,Pharmacia.)混合，置于4oC缓慢摇动2小时。1000g离心收集小珠，20倍体积LSAB洗3次后，存于4oC。2．蛋白结合实验：进行体外结合实验时，将30μl含有2μgGST融合蛋白的琼脂糖小珠及0.5-1mg细胞蛋白加入500μl低盐结合缓冲液中。置于4oC缓慢摇动1小时。洗3次，加入SDS上样缓冲液，变性后进行SDS，将凝胶用于Westernblot。条件培养基的收集：收集肿瘤细胞培养上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤，应用超滤试剂盒浓缩培养上清。将条件培养基用于蛋白双向电泳或直接处理血管内皮细胞。蛋白质双向电泳1．150μg蛋白质样品，加入重水化液（含8mol/L尿素、1%NP-40、0.28%二硫苏糖醇及少许溴酚兰）至终体积为250μl，室温放置1-1.5h。2．将固相化pH梯度干胶条安装入等电聚焦系统；加载于样品槽中。3．按照如下程序于20℃恒温下进行等电聚焦电泳：重水化14h；0-300V1h；300-500V1h；500-1000V1h；1000-2000V1h；2000-4000V1h；4000-8000V4h。4．取出胶条，置于平衡液I（6mol/L尿素、50mmol/LTris碱、30%甘油、1%二硫苏糖醇）中平衡15min；于平衡液II（6mol/L2．蛋白结合实验：进行体外结合实验时，将30μl含有2μgGST融合蛋白的琼脂糖小珠及0.5-1mg细胞蛋白加入500μl低盐结合缓冲液中。置于4oC缓慢摇动1小时。洗3次，加入SDS上样缓冲液，变性后进行SDS，将凝胶用于Westernblot。条件培养基的收集：收集肿瘤细胞培养上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤，应用超滤试剂盒浓缩培养上清。将条件培养基用于蛋白双向电泳或直接处理血管内皮细胞。蛋白质双向电泳1．150μg蛋白质样品，加入重水化液（含8mol/L尿素、1%NP-40、0.28%二硫苏糖醇及少许溴酚兰）至终体积为250μl，室温放置1-1.5h。2．将固相化pH梯度干胶条安装入等电聚焦系统；加载于样品槽中。3．按照如下程序于20℃恒温下进行等电聚焦电泳：重水化14h；0-300V1h；300-500V1h；500-1000V1h；1000-2000V1h；2000-4000V1h；4000-8000V4h。4．取出胶条，置于平衡液I（6mol/L尿素、50mmol/LTris碱、30%甘油、1%二硫苏糖醇）中平衡15min；于平衡液II（6mol/L尿素、50mmol/LTris碱、30%甘油、2.5%碘乙酰胺）中平衡15min。5．用0.5%琼脂糖将胶条封固于第二相SDS凝胶顶端，胶条一端加入蛋白质分子量标准；于15℃-20℃恒流20mA电泳至溴酚兰抵达凝胶底边。6．以银盐对凝胶进行染色或将凝胶用于Westernblot。血管形成实验：250μlMatrigel（10mg/ml）在37℃聚合30min。将内皮细胞（5×105）接种于Matrigel表面，应用不同转染物的细胞培养上清刺激内皮细胞。在40倍显微镜下观察血管形成状况。细胞运动、黏附、侵袭实验：应用安装有8μm滤膜的24孔板，在40倍显微镜下通过计数通过单层滤膜的细胞数目来评价细胞运动及侵袭能力。CAMassay:1.鸡胚准备：一定数量种蛋，置在37℃、5%CO、适当湿度的孵箱内孵育，鸡胚发育第三天2后，消毒蛋壳，制作2cm×2cm的观察窗，并抽出2ml-3ml蛋清，用无菌透明胶封闭窗口。2.载体：用明胶海绵作为载体，将不同转染物的细胞上清加入其中。3.植入：胚胎发育第8日，将载体植于CAM表面，然后用透明胶封严，继续孵育。4.观测：植入后每12小时用解剖显微镜观察1次。第12天，取出鸡胚，将植入物连同周围CAM于显微镜下观察，计数长入载体边缘的血管数。然后取下载体用甲醛固定，平行于CAM方向连续切片，计数高倍视野下的血管断面数。MouseMatrigelplugassay:1.建立气囊：大鼠麻醉后，背部皮肤常规消毒，用25号针在鼠背部皮下注射10-15ml空气，每4天重复1次。约10-14天后气囊形成，囊壁内侧为一无血管的透明膜。2．缓释载体制作：用明胶海绵制成直径为3mm的缓释载体，每粒载体中加有浓缩后的细胞培养上清。3．麻醉大鼠后于囊腔顶部切开皮肤，将缓释体置于囊腔底部，缝合伤口。4．微血管生成反应：植入10天后处死大鼠，原位观察微血管生成反应。免疫组化与MVD（微血管密度检测）：常规采用S-P法进行免疫组化染色，分别检测癌区、癌旁区和切缘区组织MVD。微血管判断：凡染成棕黄色、数个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚层的血管均不计数。先用低倍镜选取（×40）3个高血管密度区域，再转到高倍镜（×200）下计数每个区域微血管数量，以其平均值作为每例的MVD。可行性分析：1．理论上可行：肿瘤血管生成不仅是肿瘤生长的基础，而且在肿瘤侵袭与转移过程中也发挥着重要的作用，间接影响肿瘤的化疗效果。已有研究认为Rac1在缺氧状态下引起的HIF-1α表达增高中起着核心作用，而于显微镜下观察，计数长入载体边缘的血管数。然后取下载体用甲醛固定，平行于CAM方向连续切片，计数高倍视野下的血管断面数。MouseMatrigelplugassay:1.建立气囊：大鼠麻醉后，背部皮肤常规消毒，用25号针在鼠背部皮下注射10-15ml空气，每4天重复1次。约10-14天后气囊形成，囊壁内侧为一无血管的透明膜。2．缓释载体制作：用明胶海绵制成直径为3mm的缓释载体，每粒载体中加有浓缩后的细胞培养上清。3．麻醉大鼠后于囊腔顶部切开皮肤，将缓释体置于囊腔底部，缝合伤口。4．微血管生成反应：植入10天后处死大鼠，原位观察微血管生成反应。免疫组化与MVD（微血管密度检测）：常规采用S-P法进行免疫组化染色，分别检测癌区、癌旁区和切缘区组织MVD。微血管判断：凡染成棕黄色、数个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚层的血管均不计数。先用低倍镜选取（×40）3个高血管密度区域，再转到高倍镜（×200）下计数每个区域微血管数量，以其平均值作为每例的MVD。可行性分析：1．理论上可行：肿瘤血管生成不仅是肿瘤生长的基础，而且在肿瘤侵袭与转移过程中也发挥着重要的作用，间接影响肿瘤的化疗效果。已有研究认为Rac1在缺氧状态下引起的HIF-1α表达增高中起着核心作用，而HIF-1α又与肿瘤的血管生成直接相关，如果用siRNA阻断Ra