生物化学技术第十八章电泳

生物化学技术第十八章电泳课件第1页，课件共125页，创作于2023年2月内容基本概念、分类及原理聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦毛细管电泳印迹法（转移电泳）第2页，课件共125页，创作于2023年2月电泳技术的发明及发展11809年，俄国物理学家Reŭss首次发现电泳现象21937年，诺贝尔奖金获得者ArneTiselius教授，发明了最早期的界面电泳，用于蛋白质分离的研究，开创了电泳技术的新纪元。3近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。第3页，课件共125页，创作于2023年2月电泳（electrophoresis）

概念：带电颗粒在电场作用下，向与其电荷相反的电极移动的现象。第4页，课件共125页，创作于2023年2月电泳的分类显微电泳自由界面电泳：在没有支持介质的溶液中进行的电泳区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散。是目前常用的电泳系统第5页，课件共125页，创作于2023年2月纸电泳淀粉凝胶电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳：多用于核酸的分离聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离区带电泳按支持介质种类分类第6页，课件共125页，创作于2023年2月聚丙烯酰胺凝胶电泳结果琼脂糖凝胶电泳12345678MkDa97.266.444.329.020.114.3第7页，课件共125页，创作于2023年2月

根据支持介质形状不同，可分为：薄层电泳板电泳柱电泳据用途不同，可分为：分析电泳制备电泳定量电泳免疫电泳区带电泳的其他分类第8页，课件共125页，创作于2023年2月第一节电泳的基本原理电泳是在电场作用下产生的物质运动。

在一定的电场强度下，带电颗粒(分子)在电场中的迁移方式主要依据分子大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。第9页，课件共125页，创作于2023年2月若将带净电荷q的颗粒放入电场，则受到的电荷引力为

F引=E·q在溶液中,运动颗粒遵循Stoke’sLaw（斯托克斯定律）

F阻=6πrηV

当F引=F阻时

E·q=6πrηV

V=

(1)(2)(3)E·q6πrη(4)电泳的基本原理(1)第10页，课件共125页，创作于2023年2月电泳的基本原理(2)颗粒的泳动速度与颗粒形状有关。如非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力。颗粒的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和颗粒所带电荷量(q)成正比,而与颗粒的半径(r)及溶液的粘度(η)成反比。第11页，课件共125页，创作于2023年2月

由（4）可知，带电颗粒的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电颗粒在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率m（指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示颗粒的泳动情况。

m=V/E=q/6πrη（5）

由上式可以看出，迁移率仅与球形颗粒所带电荷数量，颗粒大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。电泳的基本原理(3)第12页，课件共125页，创作于2023年2月电泳（electrophoresis）电场带电颗粒溶液支持物电泳的基本要素第13页，课件共125页，创作于2023年2月影响电泳的因素颗粒性质：电荷、直径、形状电场强度溶液性质：pH、离子强度、溶液黏度电渗焦耳热筛孔第14页，课件共125页，创作于2023年2月电渗（electroosmosis）

电泳和电渗属于胶体的电动现象。电渗是指在电场作用下溶液相对于与其接触的固定的支持物作相对运动的现象。第15页，课件共125页，创作于2023年2月电渗（electroosmosis）第16页，课件共125页，创作于2023年2月聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）支持介质：聚丙烯酰胺凝胶单体：丙烯酰胺单体（acrylamide，Acr）双体，交联剂：N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，Bis）催化剂作用下聚合为凝胶分为连续系统与不连续系统两大类。第二节

聚丙烯酰胺凝胶电泳第17页，课件共125页，创作于2023年2月丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺结构式CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺（Acr）CH2=CHC=ONH

CH2NHC=OCH2=CHN,N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）第18页，课件共125页，创作于2023年2月聚丙烯酰胺结构式第19页，课件共125页，创作于2023年2月(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。聚丙烯酰胺凝胶的一般特性第20页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理不连续垂直柱状凝胶电泳不连续垂直板状电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第21页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理聚丙烯酰胺凝胶合成丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定丙烯酰胺的聚合分离效应第22页，课件共125页，创作于2023年2月凝胶总浓度（T）：Acr和Bis在凝胶中的总浓度。交联度（C）：Bis占总浓度的百分含量原理（1）：聚丙烯酰胺凝胶合成Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T=X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）C=丙烯酰胺(Acr)和双丙烯酰胺(Bis)含量的确定凝胶孔径的大小由T和C决定第23页，课件共125页，创作于2023年2月T与C的关系一般而言，C随T的增加而降低T一定时，C为5%时，凝胶孔径最小。因此目前有些实验室采用a:b=19:1a:b<10，凝胶变硬成乳白色；a:b>100，凝胶呈糊状，易断裂。第24页，课件共125页，创作于2023年2月凝胶孔径大小主要受凝胶总浓度(T)的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大凝胶总浓度(T)和交联度(C)

与孔径大小的关系第25页，课件共125页，创作于2023年2月标准胶：在总浓度为7.5%

的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10%

的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶浓度的选择第26页，课件共125页，创作于2023年2月第27页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理聚丙烯酰胺凝胶合成丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定丙烯酰胺的聚合分离效应第28页，课件共125页，创作于2023年2月丙烯酰胺的聚合化学催化系统：是在引发剂和加速剂组成的系统中完成的。有碱性系统和酸性系统光催化系统原理（1）：聚丙烯酰胺凝胶合成第29页，课件共125页，创作于2023年2月化学催化——碱性系统引发剂：过硫酸铵（Ammoniumpersulfate,AP）加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）、二甲基丙腈、二甲基丙腈亚硫酸盐微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基，这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺凝胶。第30页，课件共125页，创作于2023年2月化学催化——酸性系统引发剂：过硫酸铵(AP)

过氧化氢加速剂：硫酸亚铁-抗坏血酸（Vc)

第31页，课件共125页，创作于2023年2月引发剂：核黄素加速剂：TEMED可以加速聚合核黄素经光照后再被痕量氧氧产生自由基，引发聚合反应。光聚合催化系统第32页，课件共125页，创作于2023年2月丙烯酰胺聚合时常用的催化系统引发剂加速剂应用范围过硫酸铵（AP）N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）碱性系统3-二甲胺丙腈3-二甲胺丙腈亚硫酸盐过氧化氢或AP硫酸亚铁-抗坏血酸酸性系统核黄素TEMED碱性系统（光聚合）第33页，课件共125页，创作于2023年2月化学聚合与光聚合的比较化学聚合的凝胶孔径小，透明度好，重复性也较好，但AP可能影响蛋白质活性。光聚合的凝胶对分析样品无任何不良影响，但凝胶呈乳白色，透明度较差第34页，课件共125页，创作于2023年2月聚合影响因素大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。低温会减慢聚合反应速度。有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。第35页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理聚丙烯酰胺凝胶合成丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定丙烯酰胺的聚合分离效应第36页，课件共125页，创作于2023年2月原理（2）：分离效应

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。其分离效应包括：浓缩效应(不连续系统浓缩胶中)电荷效应分子筛效应

第37页，课件共125页，创作于2023年2月系统的不连续性表现在以下方面：

1.凝胶由上、下两层凝胶组成上层为大孔径的浓缩胶下层为小孔径的分离胶。

2.缓冲液离子组成、各层凝胶的pH不同电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

3.在电场中形成不连续的电位梯度pH8.3pH8.3pH8.9pH6.7不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第38页，课件共125页，创作于2023年2月浓缩效应（1）凝胶孔径不连续性：在电场作用下，颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带

pH8.3pH8.3pH8.9pH6.7第39页，课件共125页，创作于2023年2月在浓缩胶中pH6.7的Tris-HCl缓冲液解离出Cl-，在电场中迁移率快—前导离子或快离子。甘氨酸在pH8.3的电极缓冲液解离出NH2CH2COO-，在电场中迁移率很慢—尾随离子或慢离子。酸性蛋白在浓缩胶中解离后带负电荷（pH＞pI）。电泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中Cl-有效泳动率超过蛋白质，很快泳动到最前面，蛋白质紧随于其后，而G1y在最后面。（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性第40页，课件共125页，创作于2023年2月电泳初期，快离子向前移动，而在快离子原来停留的那部分区域则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电场强度，使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进。在快、慢离子间的蛋白质样品就在这个追赶过程中被逐渐地压缩聚集成一条狭窄的区带。第41页，课件共125页，创作于2023年2月电荷效应当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋白质在凝胶中得以分离。第42页，课件共125页，创作于2023年2月分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即分子筛效应。颗粒小，形状为圆球形的分子，通过凝胶孔时受到的阻力小，移动较快；反之，颗粒大，形状不规则的分子，通过凝胶的阻力较大，移动慢。

第43页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理不连续垂直柱状凝胶电泳不连续垂直板状电泳连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第44页，课件共125页，创作于2023年2月不连续垂直柱状凝胶电泳装置：电泳槽、玻璃管、电泳仪第45页，课件共125页，创作于2023年2月一般操作步骤：摆好玻璃管制备分离胶预电泳：除去AP、未聚合丙烯酰胺、杂质制备浓缩胶加样：浓缩胶缓冲液+样本+蔗糖/甘油+指示剂电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流取胶固定和谱带检测迁移率测定谱带保存第46页，课件共125页，创作于2023年2月加样需注意制备样品时，离子浓度不宜太高蔗糖浓度小于20%样品液中的沉淀和混浊需除去阴离子系统用溴酚蓝作指示剂，负极在上；阳离子系统用甲基绿或次甲基绿作指示剂，正级在上。第47页，课件共125页，创作于2023年2月一般操作步骤：摆好玻璃管制备分离胶预电泳：除去AP、未聚合丙烯酰胺、杂质制备浓缩胶加样电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流取胶固定和谱带检测迁移率测定谱带保存第48页，课件共125页，创作于2023年2月固定和谱带检测固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸谱带检测染色法荧光探针法特殊试剂染色法第49页，课件共125页，创作于2023年2月染色法考马斯亮蓝(G250,R250,R350)、氨基黑、阿乐辛蓝、过碘酸-Schiff试剂银试剂光显色：化学显色：双胺银染色法非双胺银染色法多银染色法干胶快速银染色法考马斯亮蓝-银染色法第50页，课件共125页，创作于2023年2月第51页，课件共125页，创作于2023年2月聚丙烯酰胺凝胶电泳结果12345678MkDa97.266.444.329.020.114.3考马斯亮蓝染色银染第52页，课件共125页，创作于2023年2月固定和谱带检测固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸谱带检测染色法荧光探针法特殊试剂染色法第53页，课件共125页，创作于2023年2月荧光探针法先荧光标记（荧光胺等），再电泳先电泳，后荧光检测（MDPF、OPA、ANS、Bis-ANS）第54页，课件共125页，创作于2023年2月固定和谱带检测固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸谱带检测染色法荧光探针法特殊试剂染色法第55页，课件共125页，创作于2023年2月特殊试剂染色法用途：用于某些酶类检测方法种类：直接染色法：适合分子量小的底物或反应产物。如氧化还原酶（脱氢酶）电泳染色法：适合分子量大、难于进胶的底物。如水解酶指示胶染色法：适合分子量大的底物、多酶参与的反应系统第56页，课件共125页，创作于2023年2月谱带保存凝胶成像法直接摄影法凝胶干燥法（长期保存）第57页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理不连续垂直柱状凝胶电泳不连续垂直板状电泳连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第58页，课件共125页，创作于2023年2月不连续垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：表面积大，温度好控制一块凝胶可点多个样品凝胶易取出可作双向电泳操作：胶板模具的制备凝胶板的制备加样和电泳第59页，课件共125页，创作于2023年2月第60页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理不连续垂直柱状凝胶电泳不连续垂直板状电泳连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第61页，课件共125页，创作于2023年2月连续的盘状凝胶电泳和垂直板电泳连续：缓冲液、pH、凝胶孔径都相同只有分离胶、无浓缩胶分离效应：电荷效应和分子筛效应用途：分离蛋白和核酸（RNA、DNA）第62页，课件共125页，创作于2023年2月线性梯度的柱状及板状凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶浓度从上至下直线增加，而孔径则从上到下呈直线降低阶梯式的柱状及板状凝胶电泳浓度和孔径呈有规律的阶梯式变化的凝胶制成的凝胶柱（或板）第63页，课件共125页，创作于2023年2月PAGE的基本原理不连续垂直柱状凝胶电泳不连续垂直板状电泳连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第64页，课件共125页，创作于2023年2月双向电泳第一维：形成pH梯度进行等电聚焦第二维：SDS凝胶电泳染色：考马斯亮兰染色或银染图像分析：自动扫描

第65页，课件共125页，创作于2023年2月第四节变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturingPAGE)

※非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nativePAGE）

在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基磺酸钠（SDS）或者尿素后，用其作为支持物进行凝胶电泳第66页，课件共125页，创作于2023年2月SDS是阴离子表面活性剂，与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致基本原理（电荷效应）一、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)第67页，课件共125页，创作于2023年2月在强还原剂（如巯基乙醇）存在下，可以打开蛋白质分子内或肽链之间的二硫键，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基排除了蛋白质的电荷和结构差异，SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分子量所决定。第68页，课件共125页，创作于2023年2月主要用途：分离蛋白质蛋白亚基分子质量的测定SDS第69页，课件共125页，创作于2023年2月操作过程凝胶的制备：用0.1%SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液配置样品制备：样品溶于1%SDS-0.1%巯基乙醇-0.01mol/L磷酸钠缓冲液电泳条件：电极液（0.1%SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2）固定与染色：考马斯亮蓝第70页，课件共125页，创作于2023年2月第71页，课件共125页，创作于2023年2月第72页，课件共125页，创作于2023年2月第73页，课件共125页，创作于2023年2月第74页，课件共125页，创作于2023年2月第75页，课件共125页，创作于2023年2月二、尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳用于DNA探针和酶解核酸产物的分离，核酸序列分析等。三、SDS-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分子量﹤10kDa的多肽第76页，课件共125页，创作于2023年2月第五节聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)是上世纪60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。第77页，课件共125页，创作于2023年2月利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续pH梯度。蛋白质是两性电解质，其pI有差异，电泳时分别聚焦于支持物上pH等于各自pI的区域。IEF第78页，课件共125页，创作于2023年2月（一）pH梯度的形成（二）电聚焦分离蛋白质IEF基本原理第79页，课件共125页，创作于2023年2月将pK和pI各自相异又相近的两性电解质溶液倾入电泳支持物中，电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于pI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。（一）pH梯度的形成第80页，课件共125页，创作于2023年2月pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后。这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极递增的连续pH梯度pH梯度的形成第81页，课件共125页，创作于2023年2月等电聚焦过程+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10第82页，课件共125页，创作于2023年2月蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，当移动至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于该蛋白质分子pI。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。（二）电聚焦分离蛋白质的过程第83页，课件共125页，创作于2023年2月＋－1098765432pHpI＝8.0蛋白质pI＝4.0蛋白质等电聚焦电泳分离白蛋白第84页，课件共125页，创作于2023年2月载体两性电解质的理化性质载体两性电解质（Ampholine)：多氨基多羧基脂肪族混合物。理化性质：缓冲性能强；导电性能好；分子量较小；紫外吸收值低；一般不与样品起化学反应第85页，课件共125页，创作于2023年2月载体两性电解质的pH范围与用量选择pH范围选择：测定未知样品的等电点时，一般先采用pH3-10的两性电解质摸索，初步测出等电点后，改用包括样品pI值的窄pH范围的两性电解质。用量选择：两性电解质通常为1-2%。第86页，课件共125页，创作于2023年2月测定蛋白质等电点的操作1、配制凝胶一般选用凝胶浓度T为5%-7.5%。在等电聚焦中，凝胶只是作为一种对抗对流的支持介质，因此，不考虑分子筛效应。同时，加入一定pH范围的载体两性电解质，以便形成连续的pH梯度第87页，课件共125页，创作于2023年2月2、加样：直接加在聚丙烯酰胺凝胶溶液中或者加在凝胶柱顶部。3、聚焦：聚焦时电极缓冲液要根据两性电解质载体的pH范围而定，电压恒定在200V/6cm，聚焦6-8h。4、固定与染色：氨基黑、考马斯亮蓝5、样品pH的测定：洗涤→冰冻切片→测pH6、蛋白质的洗脱、定量7、pI的测定：固相pH梯度电聚焦法第88页，课件共125页，创作于2023年2月1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/SDS双向电泳。其中IEF电泳（柱状）为第一向，SDS为第二向（板状）。IEF/SDS双向电泳对蛋白质的分离是极为精细的，因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。双向电泳

Twodimensionalelectrophoresis,2DE第89页，课件共125页，创作于2023年2月第90页，课件共125页，创作于2023年2月双向电泳的重要性原位细胞提取与样品处理→双向电泳→质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线双向电泳是研究蛋白质组学的关键技术，是深刻认识蛋白质结构与功能的重要工具。第91页，课件共125页，创作于2023年2月第92页，课件共125页，创作于2023年2月几种重要的蛋白质电泳1聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)2SDS常用于蛋白质分子量的测定3等电聚焦电泳(IEF)通过蛋白质pI差异分离蛋白质4双向电泳是蛋白质组学研究的重要技术第93页，课件共125页，创作于2023年2月通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定采用琼脂糖凝胶电泳法；若需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离线性DNA时，迁移率与其分子量密切相关，与碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。第三节琼脂糖凝胶电泳第94页，课件共125页，创作于2023年2月DNA的凝胶电泳第95页，课件共125页，创作于2023年2月DNA电泳步骤染色凝胶成像分析结果配制电泳缓冲液制备琼脂糖凝胶电泳加样第96页，课件共125页，创作于2023年2月（一）适合的电泳缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。第97页，课件共125页，创作于2023年2月（二）制备琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度m/V%(g/ml%)分离线状DNA的范围（Kbp)0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-32.00.1-2第98页，课件共125页，创作于2023年2月DNA样品+

载样缓冲液(loadingbuffer)（三）加样第99页，课件共125页，创作于2023年2月载样缓冲液的作用：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，加样操作更方便。第100页，课件共125页，创作于2023年2月制胶加样加入EB(0.5ug/ml)第101页，课件共125页，创作于2023年2月（四）电泳的合适电压和温度

电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意：如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。第102页，课件共125页，创作于2023年2月（五）染色常用的核酸染色剂是溴化乙啶(EB)，染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR

Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。第103页，课件共125页，创作于2023年2月溴化乙锭(

Ethidiumbromide,EB)染色

EB嵌入DNA碱基对之间，会被紫外光激发而放出约600nm的荧光.§EB为致癌物，操作时务必戴上手套!!!第104页，课件共125页，创作于2023年2月SYBR-Green染色SYBR-GreenⅠ：荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。SYBR-GreenⅡ：广泛用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的RNA或单链DNA。第105页，课件共125页，创作于2023年2月SYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission第106页，课件共125页，创作于2023年2月

（六）凝胶成像1.以紫外光做为光源.2.需使用红或黄色滤光片去除光源干扰.3.操作时须小心EB,

务必戴上手套.第107页，课件共125页，创作于2023年2月估计DNA分子量13531078872603310281/271234194118720123456M12(bp)第108页，课件共125页，创作于2023年2月DNA粗略定量20kb12kb10kb6kb1.2kb0.8kb第109页，课件共125页，创作于2023年2月