熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定实验报告剖析

熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定华南师范大学09化一摘要：肉制品是一类深受人民群众喜爱的食品， 在其生产过程中多采用亚硝酸盐作为发色剂，它不仅能使肉制品保持良好的色泽，还能抑制肉毒梭状芽孢杆菌，保证肉制品的后熟风味。但近年来由于亚硝酸盐摄入量过多引起的食物时中毒时有发生，且加硝处理过的肉制品中的亚硝酸盐可与胺类生成强致癌物亚硝胺， 对人体健康产生潜在的危害。本实验用紫外分光光度法测定熏肉制品中亚硝酸盐的含量。关键字：熏肉制品 亚硝酸盐 紫外分光光度法 标准曲线法 盐酸-萘乙胺引言 盐的性质:亚硝酸和硝酸的钠盐和钾盐常被加入用于腌肉的混合物中， 用来产生和保持色泽、抑制微生物和产生特殊的风味。此外，亚硝酸盐150-200mg/kg）可抑制罐装碎肉和腌肉中的梭状芽孢杆菌。亚硝酸盐的抗微生物作用为它使用于可能生成长肉毒梭状芽孢杆菌的腌肉中提供了正当的理由。亚硝酸盐含量只要控制在安全范围内使用不会对人体造成危害。肉制品中，亚硝酸盐含量不得超过30mg/kg，这是因为亚硝酸盐的中毒剂量是200毫克以上，而正常膳食中的亚硝酸盐即使是大量用亚硝酸盐做食品添加剂的肉类，也不会超过毫克。中毒后症状：亚硝酸盐是不会蓄积在体内的， 膳食中绝大部分亚硝酸盐随尿排出，不会对人体造成危害。过量亚硝酸盐进入人体，会氧化血液中的血红蛋白为高铁血红蛋白，后者无携氧功能，导致组织缺氧，引起肠原性青紫症，皮肤青紫是本病的特征，尤以口唇青紫最为普遍。口服亚硝酸盐 10分钟至3小时后，可出现头晕、恶心、呕吐等症状。严重者出现意识丧失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡。亚硝酸盐作用机理发色机理当血红蛋白中的铁处于+2（亚铁）并且缺乏配体键合所需的第 6部位时，它被称为肌红蛋白，是由珠蛋白和血红素组成的络合物，位居血红蛋白中央的

H2NNH2HOOC(CH2)2N(CH2)2COOHH3CCH3NNNFeNHCCH3H2CHCCH2CH3H2O(O2)图1.血红蛋白结构图铁原子(d2sp3)具有6个配位部位，其中4个分别被4吡咯环上的氮原子占据，第5个配位部位与珠蛋白的组氨酸残基键合， 剩余的第6个配位部位可与各种配基提供的电负性原子络合。亚硝酸盐为强氧化剂，进人人体后，可使血中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去运氧的功能，导致组织缺氧。亚硝酸盐在肉中形成一氧化一氮，而一氧化一氮与血红素类化合物作用生成亚硝酰肌红蛋白，这种色素产生了腌肉的红色。目前我国测定的食品中亚硝酸盐含量的方法有：离子色谱法，分光光度法，气相吸收光谱法，示波极谱法，格里斯试剂比色法 。离子色谱法的原理：试样经沉淀蛋白质，出去脂肪后，采用相反的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测，以保留时间定性外标法定量。分光光度法法原理：试样经沉淀蛋白质，出去脂肪后在弱酸条件下， 亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色 染料，外标法测定亚硝酸盐含量。气象吸收光谱法原理：在0.15～0.3mol/L柠檬酸介质中加入，将亚硝酸盐瞬间转化成NO2。用空气载入气相分子吸收光谱仪的吸光光谱中，在 213.9mm等波长处测得的吸光度与水样中亚硝酸盐浓度遵守比尔定律， 以此计算出亚硝酸盐的含量。现实生活中，食品检测人员经常采用亚硝酸盐快速测试盒测定食品中亚硝酸盐的含量，亚硝酸盐快速测试盒采用 N-1-萘乙二胺代替传统的 a-萘胺，使显色的灵敏度高，显色的摩尔质量增大，测定出来的结果更准确，但鉴于各方面的局限性，本实验我们采用紫外分光光度法，以a-萘胺为显色剂测定熏肉制品中亚硝酸盐的含量。其实验原理如下：实验原理：自样品中抽提分离出亚硝酸盐， 亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐， 此重氮盐再与α-萘胺试剂发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物。其颜色的深度与样液中亚硝酸含量成正比， 可比色测定。反应式如下：NO2-+H++H2NSO3HNN+SO3H+H2ONNNN++SO3HNH2SO3HNH211000X肉制品中亚硝酸盐含量==1000（mg/kg）401m50500式中：X为由测得的吸光度什在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μ g/mL）；m为样品质量（g）。主要试剂及仪器所有加入的量都要准确加入1）亚铁氰化钾溶液：称取10.6克亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水，并稀释至100mL。2）乙酸锌溶液：称取22.0克乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100mL。3）饱和硼砂溶液：5.0克硼酸钠（Na2BO4·10H2O）溶于100mL热水中，冷却备用。4）0.4%对氨基苯磺酸溶液（4g/L）。称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，置棕色瓶中，混匀，避光保存。5）0.2%盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)。称取0.1g盐酸奈乙二胺固体溶于去离子水，定容至50mL。6）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：精确称取0.1000克于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠（优级纯），加水定容到500mL。7）亚硝酸钠标准使用溶液（5μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL的容量瓶中，加水稀释到刻度。8）仪器：①研钵，②分光光度计，③分析天平，④2mL、5mL、10mL移液管各2支，⑤100mL容量瓶3个⑥200mL容量瓶1个，⑦500mL容量瓶1个，⑧50mL容量瓶10支，⑨滤纸，⑩100烧杯，玻璃棒实验操作(1)样品处理样品中硝酸盐及亚硝酸盐的提取： 称取经搅拌混合均匀的样品 5克于50mL烧杯中，加入硼砂饱和溶液 12.5mL，以玻璃棒搅拌，然后用 70℃左右的重蒸馏水约300mL，将其稀释转移到 500mL容量瓶，（烧杯）沸水浴中加热 15分钟，取出，一边转动一边加入 5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加 5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。冷却到室温，用蒸馏水定容，摇匀。放置片刻，去除上层脂肪，清液用滤纸过滤。(2)亚硝酸钠标准曲线的绘制用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液 (5μg/mL)0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5mL(各含0，1，3，4，5，7.5，10，12.5μg亚硝酸钠)于一组50mL容量瓶中，各加水至 25mL，分别加 2mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入 1mL0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到 50mL，摇匀。静置15min后（时间取吸光度最大的显色时间）用 20mm比色皿，用分光光度计在540nm波长（选择吸光度最大的吸收波长） 下测定吸光度，以蒸馏水为空白。以测得的各比色液的吸光度对应的亚硝酸浓度作曲线。 比色液中亚硝酸钠浓度为 0～0.30μg/mL时，两者呈线性关系。本法的标准偏差为± 3.0%。(3)亚硝酸盐的测定取20mL待测液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀。静置3～5分钟后，加入0.5mL02%α-萘胺溶液，比色测定，记录吸光度。根据标准曲线方程算得相应的亚硝酸钠浓度（μ g/mL），计算试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量。结果与讨论最大吸收波长的选择以蒸馏水为背景溶液，用0.08μg/mL的亚硝酸钠溶液在波长450-600的不同吸光度如下表：波长450460470480490500510520吸光度0.0070.0090.0130.0170.0230.0290.0410.050波长530540545550560570580590吸光度0.0570.0610.0600.0590.0580.0490.0380.024吸光度0.070.060.050.04吸光度0.030.020.0100 100 200 300 400 500 600 700由以上的图表可看出在吸收波长为 450-540，溶液的吸光度不断增大，吸收波长为540-590，溶液的吸光度不断减少。所以， 540处为溶液的最大吸收波长。2.最优显色时间的选择以蒸馏水为背景溶液，浓度为 0.08μg/mL的亚硝酸钠盐溶液，加入 1mL的显色剂，在显色时间分别为0min，5min，10min,15min,20min时测定它们的吸光度，结果如下表：显色时间0min5min10min15min20min吸光度0.0580.0640.0650.0640.064由上表可以看出，溶液的吸光度受时间的影响不大， 显色时间为15min时，溶液的吸光度最大，所以 10min为最佳显色时间。3.最佳显色用量的选择以蒸馏水为背景溶液，以浓度为0.08μg/mL的亚硝酸钠盐溶液，分别加入0.5mL,1mL,1.5mL,2mL,2.5mL,3.0mL的显色剂用量，显色时间为15min时分别测定它们的吸光度，记录数据，如下表;显色剂用量0.5mL1.0mL1.5mL2.0mL2.5mL3.0mL吸光度0.0580.0640.0650.0610.0630.063由上表可以看出，溶液的吸光度受显色剂的用量的影响是有波动的， 规律不是很明显，但不难发现，当显色剂用量为 1.5mL时，吸光度最大，所以显色剂的用量为1.5mL为最佳用量。4.最佳背景溶液的选择分别以①去离子水，②对氨基苯磺酸溶液，③对氨基苯磺酸加氯化钠溶液和④对氨基苯磺酸加显色剂溶液为背景溶液测定浓度为 0.010μg/mL的亚硝酸钠盐溶液的吸光度。背景溶液吸光度①去离子水0.076②对氨基苯磺酸溶液0.076③对氨基苯磺酸加氯化钠溶液0.067④对氨基苯磺酸加显色剂溶液0.067由上表看出，以去离子水或对氨基苯磺酸溶液为背景溶液， 它们的吸光度都最大，为0.076，但去离子水简单，因此实验时我们选择去离子水为背景溶液。5.亚硝酸钠标准曲线的绘制由前面的四个步骤探索出来的四个条件为标准，分别向不同浓度的标准溶液加入1.5mL显色剂，显色时间为 10min，以去离子水为背景溶液，在吸收波长为540nm处，测定不同浓度的标准溶液的吸光度，绘制标准曲线：浓度0.000.020.040.060.080.100.150.20吸光度0.0070.0230.0430.0500.0610.0760.1170.151亚硝酸钠盐的标准曲线0.16y=0.7102x+0.00880.14R2=0.99650.120.1吸光度线性(吸光度)0.080.060.040.02000.050.10.150.20.256.样品溶液的吸光度的测定：样品溶液的吸光度： 0.026把数据代入亚硝酸钠盐的标准曲线： y=0.7102x+0.0088得：x=0.024211000X肉制品中亚硝酸盐含量==1000（mg/kg）401m50500式中：X为由测得的吸光度什在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；m为样品质量（g）。计算得肉制品中亚硝酸盐含量为：3.025mg/kg所以实验的肉制品中亚硝酸盐的含量没有超过国家给定的标准，为合格品。参考文献[1]《食品与食品添加剂等规格标准（摘录） 》日本食品卫生学会编 人民卫生出版社《食品分析原理与技术》，李超编著，科学技术文献出版社.《国外食品分析法》，上海商品检验局编，上海科学技术文献出版社.《食品中添加剂的分析方法》，日本厚生省环境卫生局食品化学课编，中国标准出版社.[5]《食品分析》，天津与无锡轻工业学院合编，中国轻工业出版社 .《食品化学综合实验》，黄晓钰，刘邻渭主编，中国农业大学出版社.《食品化学（第三版）》，[美]OwenR.Fennema著,王璋等译，中国轻工业出版社2003.《社会调查研究方法》，仇雨临,何凡兴编,中国劳动出版社1995.实验心得这一次的设计性实验，我花了很多的心血，我们实验之前查阅了很多的关于熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定的文献， 了解到目前测定亚硝酸含量的方法一般都集中在紫外分光度发，不同的知识显色剂的选择的不同， 刚开始我们确定的显色剂是α-萘胺溶液，后来经过小组讨论决定选择盐酸乙二胺。 经过查阅文献我们也初步了解到，目 前国家规定的标准是食品中亚 硝酸盐的含量不得 超过30mg/kg。但是实验过程仍然出现了一些问题。本次探究性实验，我们探索了四个条件，分别是显色剂的用量、显色时间、最大吸收波长的选择和背景溶液的选择。有时实验前没有充分的设计好，配溶液时，没有到分光光度室就加了显色剂，这样就不能很好地控制显色剂的显色时间， 没办法，我们只好把之前配的溶液倒掉，重新配制。虽然浪费了好多时间，可是还是值得的，探究嘛，就是一步一步的做好，不行，就重来。我们小组做实验做到下午 5点左右，差不多是最后走的一个小组，不过我们都很开心，因为大家都在用心的做，没有丝毫的马虎。最重要的是，我们觉得我们的实验数据还是蛮准确的， 系统误差应该没有。到处理数据的时候，果不其然