农业植物病理学：南方水稻黑条矮缩病

南方水稻黑条矮缩病病毒的概念是一类比较原始的、结构简单的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物。由核酸和蛋白衣壳组成，是分子寄生物。简要回顾植物病毒的蛋白种类结构蛋白：主要是衣壳蛋白(coatprotein，缩写为CP)。非结构蛋白：包括病毒复制需要的酶（复制酶），传播（传毒相关因子）、运动需要的功能蛋白（运动蛋白）和基因沉默抑制子（克服寄主的防御反应）等。植物病毒的核酸类型：植物病毒的核酸只有RNA或DNA两种，按核酸的种类和其在复制过程中的功能，可分为5种类型病毒。正单链RNA(十ssRNA)病毒负单链RNA(-ssRNA)病毒双链RNA(dsRNA)病毒单链DNA(ssDNA)病毒双链DNA(dsDNA)病毒

植物病毒进入细胞的途径机械微伤（finewound）传毒介体直接注入LeafBeforeRubbingLeafAfterRubbingAphidfeedinginPhloem植物病毒的传播植物病毒从一植株转移或扩散到其它植物的过程称为传播（transmission)

。根据自然传播方式的不同，传播可以分为介体传播和非介体传播两类简要回顾：TransmissionMechanismsUsedbyPlantVirusesPlanttoPlant

Mechanical Vegetative Seedborne Pollenborne NaturalRootGraftsVectors Dodder（菟丝子）

Insects Mites Fungi NematodesDoddertransmission:Mostlyexperimentalbutcanbenatural.介体传播植物病毒的介体种类很多，主要有昆虫、螨类、线虫、真菌、菟丝子等。在传毒介体中，昆虫是最主要的介体，其中70%为半翅目的蚜虫、叶蝉和飞虱，而又以蚜虫为最主要的介体。目前已知的昆虫介体约有400多种，其中约200种属于蚜虫类，130多种属于叶蝉类。第一节昆虫传植物病毒病国家粮食安全需求农业是安天下、促发展、稳民心的战略产业。2012年我国粮食自给率下降到90%以下，突破了《国家粮食安全中长期规划纲要(2008-2020年)》的粮食自给率稳定在95%以上的红线。农作物生物灾害种类：病害720余种虫害830余种杂草100多种鼠害60余种病虫害防治年损失比率年损失量

年口粮不防治约37％约2亿吨4－5亿人防治（目前水平）约10%约5000万吨1.5－2亿人防治（未来水平）<3%<1000万吨约3000万人多挽回1%的损失＝500万吨粮食＝1千万人口粮(1年)

＝35亿美元＝1.5艘“辽宁号”航空母舰病虫害防治＝粮食增产植物病毒病害有“植物癌症”之称，每年引起作物经济损失高达600亿美元。虫传病毒的暴发和威胁目前已报道植物病毒约1100种，其中虫传病毒约占80%。

我国主要虫传水稻病毒灰飞虱传水稻条纹病毒褐飞虱传水稻齿叶矮缩病毒白背飞虱传南方水稻黑条矮缩病毒黑尾叶蝉传水稻矮缩病毒灰飞虱传的水稻条纹病毒大规模流行与危害

灰飞虱传的水稻黑条矮缩病毒近年来严重威胁我国水稻和玉米生产白背飞虱传的南方水稻黑条矮缩病毒的暴发流行

针对一些虫传病毒病害，农民上访频繁，引起严重的社会稳定问题。2010年湖南、湖北、福建等上访400多起。虫传病毒病害引起的社会问题种子问题！病毒问题！No！“打农药”“更多地打农药”耐药性增加病害再爆发虫传病毒病害防治难题可经卵传播传毒所需时间短面临问题缺乏抗病作物资源防虫治病不能解决生产根本问题虫传病毒促进介体昆虫发生与暴发←←←增殖循回病毒致病传毒获毒病毒如何致病？寄主如何防御病毒？昆虫如何识别和传播病毒？经卵传播介体昆虫、病毒和寄主植物三者复杂性状互作机制寄主防御目前研究存在的问题植物病毒介体昆虫寄主植物识别获毒抗病致病防御取食传毒介体昆虫—病毒—寄主植物复杂性互作关系

关键科学问题韧皮部口针唾液腺肠道卵巢传毒经卵传播识别侵入？？？1、介体昆虫识别及传播病毒的分子机制

2、虫传病毒和寄主植物致病与防御机制能量代谢基因表达发育调控致病机理防御机制R基因抗性RNA沉默植物抑制子转录组学、蛋白质组学、代谢组学、分子生物学及生物化学虫传植物致病机理与寄主防御机制3、虫传病毒侵染导致的昆虫对植物互作及致灾机理解析以病毒为联系点的昆虫与植物之间的相互作用微观分子生物学植物次生代谢产物及抗虫信号通路植物营养成分昆虫免疫及病毒分子变异宏观生态学昆虫取食行为昆虫生殖行为昆虫种群增长JA萜类营养成分病毒传播及流行昆虫体内病毒变异4、借鉴模式生物体系研究三者互作机制利于模式禾本科植物—短柄草鉴定抗病毒新基因研究模式昆虫—果蝇的抗病毒机制第二节南方水稻黑条矮缩病2010年,我国南部13个省区发现病害，超过500万亩中稻、2000万亩晚稻受害。2009,我国南部9省区及越南北部19省报告有该病发生，晚稻总受害面积约500万亩。2001-2008年，病害发生逐年上升2001年首次在广东阳西县发现新病毒病——南方水稻黑条矮缩病严重威胁粮食安全和社会稳定越南北部28省及中部1省见病，冬春稻受害28306ha(42万亩)，夏稻受害23266ha(35万亩)，其中河静省(HaTinh)有500ha(7500亩失收)日本熊本县(KumamotoPrefecture)检测到该病害，零星发生于全县粳稻及籼稻上湖南：2010年，水稻发病946.6万亩，中稻绝收面积5.3万亩，晚稻绝收面积1.6万亩，损失稻谷4.64亿斤。浏阳市一个县级市绝收面积2万亩，市政府从农业保险中赔偿1400万元。福建：5%以上发病面积124万亩！福建省委书记孙春兰做出批示！江西：459万亩，损失30%以上7.4万亩，绝收面积0.4万亩。扬两优6号、丰两优4号、两优036、两优363等品种发病严重。越南：39个省发病一、南方水稻黑条

矮缩病的诊断要点1.病毒病与真菌、细菌、线虫等传染性病害的区别2.与生理性病害的区别独特性分散性系统性五性传染性鲜明性分散性系统性传染性鲜明性蜡状脉肿倒生气生根SRBSDV特征性是什么病毒病？独特症状叶色绿/暗绿叶背、叶鞘有条状突起叶背、叶鞘有线状脉肿叶背、叶鞘有小瘤状突起叶片无虚线状条点叶片有虚线状条点叶片有条纹，心叶有断续条斑/捻转黑条矮缩瘤矮齿矮矮缩簇矮条纹叶枯叶色黄/浅黄叶片、叶鞘浅黄，叶片短窄，间有褐斑叶片黄化，叶鞘绿色草矮黄叶东格鲁株形松散株形紧凑南方水稻黑条

矮缩病的诊断的特征性症状诊断的特征性症状：脉肿,主要集中在茎杆基部,长度1-5mm，表面凹凸不平,叶鞘上和叶背也有少量脉肿出现,初为腊白色,后为黑褐色,一般在生长中后期出现。诊断的辅助性症状：倒生气生根、病株明显矮化,心叶叶尖卷曲,叶缘缺刻。识别要点：矮缩、叶片浓绿矮化矮化、叶片浓绿蜡状脉肿倒生气生根叶缘缺刻、叶尖卷曲叶缘黄化叶缘黄化叶缘缺刻受病毒侵染后发病的苗床秧苗症状早期田间矮化症状分蘖期症状晚期症状拔节期后症状玉米上的南方水稻矮缩病毒病症状二、病原及传毒方式

由华南农业大学周国辉教授首先发现鉴定命名的一个病毒新种主要经白背飞虱传播，不经种子传播已知可侵染水稻、玉米、稗草、薏米等

南方水稻黑条矮缩病毒的整个基因组为10个线性dsRNA片段，分别为S1-S10，其中S5-2、S6、S7-1，S7-2，S9-1和S9-2编码非结构蛋白。福州RBSDV样品公安SRBSDV样品孝感SRBSDV样品福州SRBSDV样品传毒介体：白背飞虱♂♀白背飞虱长翅型白背飞虱短翅型传毒方式：

持久性传毒，不经卵传。获毒时间10-30分钟；体内循徊期5-7天；传毒时间5-10分钟；若虫传毒效率高于成虫自然带毒率：健株上发育的成虫不带毒；

病株上发育的成虫带毒率为70%~80%；

2010年春、夏季华南地区灯下成虫带毒率2%左右（最高8%）三、病害侵染循环中、晚稻发病过程入侵初显扩散为害成灾重病田形成本田期1~2次再扩散中、晚稻重病田形成过程秧针期飞虱带毒入侵并产卵秧田后期下代飞虱带毒扩散病害侵染循环病毒在冬种水稻、玉米及杂草上越冬白背飞虱取食获毒虫源地带毒白背飞虱随气流远距离迁飞（春季由南向北）白背飞虱取食迁入地早稻、玉米及杂草传毒白背飞虱扩繁并从毒源植株上获毒带毒白背飞虱再迁飞及短距离转移中、晚季稻早期受侵严重发病白背飞虱带毒随气流南回其他介体取食获毒四、发生规律与流行影响因素（一）田间发病特点中、晚稻病重于早稻杂交稻病重于常规稻

田块间病情差异明显地区间病情差异大，同一地区年度间病情差异大病株田间分布田块间差异大（二）流行影响因素植物非生物因素病毒、介体植物生命系统（不和谐）代谢功能失常

植物为何感染病毒病？病毒病为何流行？植物生命系统非生物因素病毒、介体人为干预不当农业生态系统（不和谐）爆发性间歇性迁移性流行三性虫传植物病毒流行三性寄主介体病毒植物病毒流行影响四因素环境植物对病毒群体进化的影响植物对介体种群的影响病毒对介体种群的影响介体对病毒流行的关键效应植物病毒流行的基本条件致病性强的病毒感病寄主介体数量大、带毒率高适宜的环境条件为什么杂交稻发病较重？1、秧苗嫩绿粗壮：传毒白背飞虱入侵多且早，产卵早且多，繁殖速度快2、单苗插植：一株即一丛，一旦发病无丛内补偿效应3、栽后返青快：秧苗带虫、带卵成活力高，田外白背飞虱迁入量大4、尚无抗虫抗病品种：白背飞虱喜嗜交杂稻。杂交稻秧苗粗壮高大，早期入侵飞虱可繁殖一代，移栽后无明显的落黄期，有利于飞虱发育和繁殖

1.寄主水稻杂交稻诱发白背飞虱爆发？杂交稻白背飞虱周国辉，20102.传毒介体——白背飞虱（1）为何近年白背飞虱大发生？白背飞虱华南稻区4-5月迁入，早稻田可以落地成灾。在长江中下游稻区，主害代早稻为7月中下旬，单季稻为7月下旬至8月上旬。晚稻为9月上中旬。全年以早稻穗期、单季中稻和连作晚稻前中期的虫量最大，为害最严重。6月份梅雨季节的降雨量、降雨日直接决定早稻白背飞虱主害代的迁入量。若虫稻飞虱哪儿来？？？白背飞虱携毒远距离迁飞白背飞虱携毒远距离迁飞.…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………...…….…..…………………..………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………白背飞虱及其携带病毒有可能从海南传至越南，再从越南传至中国内陆白背飞虱&SRBSDV侵染循环周国辉2010稻飞虱大发生记录（1949-2010）年份19681974197519801982198319851987发生情况主要稻区大暴发主要稻区大发生全国稻区大发生长江中下游大发生南方稻区大发生长江流域大发生长江中下游大发生长江流域和华南大暴发面积(万公顷)?930126712001337142112851821年份1988199119931997200020052006…2010发生情况南方稻区中偏重,局部大发特大爆发四川省大发生全国大发生局部偏重和大发生特大爆发(BPH)特大爆发(BPH)特大爆发面(万公顷)1170232314391921158326663300？？？绿色革命生物型2抗性品种+农药农药不济特效农药

农药抗性

生态崩溃稻飞虱危害状况郭荣，20102009年6月迄今，发生面积>100万公顷，损失100万吨，政府支付6000万美圆补偿费、2000万美圆的免费农药。病毒病流行广泛。截止2011年6月，11%稻田受害，损失6亿泰珠。2009/2010亚洲稻区稻飞虱爆发情况杂交稻地区以白背飞虱为主南方黑条矮缩病在华南和越南北部爆发，30万公顷受灾。云南省的56个县在水稻前期有40万公顷早稻遭白背飞虱危害。印度尼西亚爪哇BPH开始成灾，已有1万公顷受害。LightdamageMediumdamageHeavydamageFullcroplossTotal52203311114268110,354

各国连续发生虱烧PhilippinesVietnamMalaysiaChinaThailandBangladesh2010年3月27日，泰国Chainat遭遇虫雨2010年3月27日泰国中部BPHRain，ChaiNat27March2010ChaiNatThaneeHotelNetcatchesofBPHbysweeping50timesChaiNat,27March2010农药引起的虱烧

PicturesbyPhamvanQuynh农药引起褐飞虱再猖獗1982年,国际水稻研究所大量杀伤天敌刺激稻飞虱生殖改善营养条件不合理使用农药中国农药年使用量X6X32X127X2X59X33X0.9X19X27BPMC吡虫啉氟虫腈对农药的抗性Heong

害虫

天敌

植物生殖能力存活能力资源竞争农药抗性营养条件生存空间控制功能农药耐性农药再猖獗不合理用药导致生态系统崩溃稻飞虱入侵农药降低了系统对稻飞虱的抗性暴发IRRI，2009农药经销商多平均一个县城批发商10家、一个乡镇零售商20家，全国至少有30000批发商、50万零售商。2006年统计,我国有2861个县,40000个乡镇,农作物病虫害发生面积60亿亩。江西某农药零售店过量施用氮肥2003年,国际水稻研究所India92.6VietNam114.3Phillipines51.3Japan100US153.8

China180

长三角270-300

浙江双季150-225

单季180-250

氮肥过量氮肥诱导稻飞虱4foldincreaseinNfrom100Nto400Ncanresultin40foldincreaseinBPHdensityat100days.100N400NHeong,2008（2）为何白背飞虱高效传毒？生物学实验结果（引自周国辉）无毒白背飞虱获毒取食时间和传毒取食时间多数为30分钟以上，最短5分钟。病株上扩繁的二代白背飞虱带毒率为70%左右；90%左右带毒白背飞虱具有传毒能力；多数白背飞虱获毒后需间隔5-10天（循徊期）才能传毒。白背飞虱高效获毒和传毒能力

（福建农林大学）高效获毒：80%-100%的1-2龄若虫可以获毒。高效获毒：循回期短，有少量若虫经过3天时间即可传毒，多数5-8天可传毒。X

SRBSDV病毒粒体介体白背飞虱

√

难点:植物病毒的介体昆虫传毒机理

√

病株为什么白背飞虱可以高效传毒？ArchVirol,2012;JVIP7-1小管病毒粒体P9-1-Rhodamine病毒原质P9-1抗体病毒原质SRBSDV在介体细胞内的复制场所：病毒原质SRBSDV在介体细胞间扩散——包裹病毒的小管(?)SRBSDV在白背飞虱体内复制周期的可能模型。病毒原质包裹病毒的P7-1小管伸出细胞膜进入邻近细胞P7-1抗体鉴定出与病毒在介体细胞中复制和扩散相关的2个非结构蛋白：P9-1、P7-1P7-1抗体SRBSDV在介体白背飞虱体内的侵染循回过程五、南方水稻黑条

矮缩病的监测技术实验室诊断技术（1）针对核酸：dsRNA基因组快速鉴定、RT-PCR检测、核酸斑点印迹法

（2）针对蛋白：ELISA检测、斑点免疫、WesternBlot①dsRNA基因组快速鉴定RGDVRDVRDVSRBSDVRDVRRSVSRBSDVSRBSDVRRSVRRSV每一种水稻dsRNA病毒都有特异性基因图谱提取病毒dsRNA基因组的快速方法dsRNA的快速小量提取法简要步骤：（1）研磨：典型症状的水稻病叶于液氮研磨成粉末；（2）抽提：用2×STE及酚、氯仿抽提，低速离心；（3）吸附：上清液调至含17%乙醇的溶液，与含17%乙醇的1×STE平衡过的纤维素（CF-11）混合，促使核酸吸附；（4）洗涤：用含17%乙醇的1×STE反复洗涤，直至CF-11变白为止。（5）洗脱处理：用不含乙醇的1×STE洗脱，洗脱液用异丙醇、乙醇沉淀后真空抽干，即为dsRNA。两种dsRNA基因组的提取方法比较dsRNA基因组快速鉴定存在问题当两种病毒dsRNA基因组电泳图谱相同或相似时，无法用该方法区分，如RBSDV和SRBSDV福州RBSDV样品公安SRBSDV样品孝感SRBSDV样品福州SRBSDV样品福建省病毒检测分布②RT-PCR验证基于引物PS10A/PS10B的RT-PCR检测1,湖北公安样品；2,湖北孝感样品；3,SRBSDV福州样品；4,RBSDV福州样品

基于引物PJF/PPJR/PNJR的RT-PCR检测1,RBSDV福州样品；2,SRBSDV福州样品；3,SRBSDV福建连城样品；4,湖北公安样品；5,湖北孝感样品；6,白背飞虱；7,灰飞虱③核酸斑点印迹法

厦门同安区3月29日至4月10日灯下白背飞虱样品，共31只，其中2只带毒，带毒率为6.45%

。实验室条件下，在水稻病株上饲毒后度过循回期的白背飞虱检测21头，有19头获毒，带毒率为90.47%。海南琼中县12株水稻疑似样品经过检测4株为水稻锯齿叶矮缩病毒，1株为水稻南方黑条矮缩病毒。福建新罗检测的40只白背飞虱样品有1头携带SRBSDV。福建永安市检测的76只白背飞虱样品有1头携带SRBSDV。福建蒲城检测的168只白背飞虱样品有4只携带SRBSDV。

④

酶联免疫吸附方法（ELISA）：检测病株或白背飞虱带毒率直接ELISA间接ELISA双抗夹心ELISA酶标板Solidphase=12孔、48孔、96孔空白阴性阳性一步法ELISA检测白背飞虱带毒率√2.封闭，0.5小时洗板3次

3.加样品和酶标记抗体，45分钟洗板3次每只白背飞虱一个搓管，样品处理控制在20分钟完成

EEEE√1.包被抗体，1小时洗板3次

4.加底物，显色15分钟，直接肉眼观察判断结果⑤

斑点免疫检测：检测病株或白背飞虱带毒率DOT-ELISA快速检测技术1）仪器设备电子天平（精密度达到1毫克）、精密pH酸度计、高速台式离心机（最高转速达12000转/分钟）、计时器、恒温水浴摇床、水平摇床、微量移液器（10微升、100微升及1000微升）。电子天平精密pH酸度计高速台式离心机恒温水浴摇床水平摇床微量移液器研钵2）试验耗材一次性乳胶手套、研钵（直径=60毫米）、枪头及枪头盒、小离心管、烧杯、量筒、试剂瓶、硝酸纤维素膜、铅笔、直尺、剪刀、记号笔、标签纸。3）试剂配制碳酸盐缓冲液：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加二次蒸馏水定容至1000mL。1M/LTris-HCl（pH8.0）：取Tris碱12.1g，加80mL二次蒸馏水溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100毫升。TBST缓冲液：取NaCl8.8g，1M/LTris碱20mL，向烧杯中加入约800mLddH2O，充分搅拌溶解，加入0.5mL吐温-20，充分混匀，定容至1000mL，4℃保存。封闭缓冲液：称5g脱脂奶粉，加入到100mLTBST缓冲液中（现配现用）。南方水稻黑条矮缩病抗体溶液：抗体使用前用封闭缓冲液按1:1500稀释，﹣20℃保存。碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗兔二抗：使用前用抗体稀释液按1:30000稀释，4℃保存。（6）辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗：抗体使用前用封闭缓冲液按1:1500稀释，﹣20℃保存。（7）四唑硝基蓝（NBT）溶液：在1.5mL小离心管中，称取四唑硝基蓝50mg加入1mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）振荡摇匀，-20℃保存。（8）5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐溶液（BCIP）（50mg/mL）：在1.5mL小离心管中，称取BCIP50mg，加入1mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），振荡摇匀，-20℃保存。（9）底物缓冲液（水稻）：取Tris碱12.1g，氯化钠5.84g，氯化镁10.2g，加800mLddH2O，溶解后加浓HCl调pH至9.5，定容至1000mL。（10）底物显色缓冲液（飞虱）：取4-氯-1-萘酚12.1g，无水乙醇2mL，0.02MPBS10mL，7μLH2O2。3）水稻样品试验步骤（1）取NC膜，用铅笔画1cm正方格。（2）取3～5g感病或待检水稻茎部组织剪碎，加液氮磨成粉，待液氮挥发后，按照质量体积比1:2（g/mL）加入碳酸盐缓冲液后，继续研磨至透明状、无可见颗粒，转移至EPP管，4℃，12000g，离心10min，采用100μL微量移液器小心吸取上清，转移至另一EPP管，-20℃保存。采用同样的方法，提取健康水稻和感病水稻（经PCR确认）同一组织部位样本的上清液，作为阴性对照和阳性对照。（4）去掉NC膜的上下层保护纸，在NC膜毛面的每个方格内上样5μL，并记录上样顺序，试验设阳性（感病）和阴性（健康）对照。（5）膜置室温自然晾干后，浸入5%脱脂奶粉封闭缓冲液，37℃封闭40min。（6）按1:1500稀释抗体封闭缓冲液。（7）倒掉步骤(5)中膜的封闭液，加入步骤(6)中的抗体溶液，37℃，轻摇（转速≤20转/分钟）1hr。（8）倒掉抗体溶液，用TBST缓冲液洗膜3次，每次3min；（9）取二抗0.5μL，加入到15mL封闭缓冲液中。（10）将膜浸入二抗缓冲液中，37℃，轻摇30min。（11）倒掉二抗缓冲液，用TBST洗膜3次，每次3～5min。（12）加底物缓冲液，平衡2～3min，弃缓冲液。（13）在室温下，依次加入底物缓冲液10mL、NBT25µL、BCIP15µL，待阳性处理显示斑点，阴性没有斑点，倒掉显色液，用ddH2O冲洗，中止显色，并拍照保存。4）飞虱样品试验步骤（1）取白背飞虱（单头或多头），按每头加入10-20μL飞虱处理缓冲液，置于0.2mL离心管中，用牙签捣碎，瞬时离心后取上清点至NC膜上。（2）其余步骤与水稻约相同，仅是二抗溶液换成HRP-羊抗兔二抗溶液。抗体稀释比按照1:3000。（3）倒掉二抗缓冲液，用TBST洗膜3次，每次3～5min。（4）加入底物显色液。5）水稻秧苗早期感染和病毒感染极早期的检测采用本实验室研制的水稻处理试剂，提高敏感性。6）对于叶绿素含量较高的样品。12345678910111213141516171812345678DOT-ELISA改进的DOT-ELISA样品来源：2011年广西样本、2011年云南思甸、2010年贵州荔波、2010年贵州独山等。⑥IC-RT-PCR抗体稀释液加入PCR中37℃孵育包被加入水稻或飞虱样品提取液，

37℃孵育弃去抗体稀释液弃去提取液，加入RT-PCR试剂，PCR扩增PAGE电泳分离，鉴定抗体生物学性质的评价1.5hr1.5hr2hr1.5hr共6.5hr采用抗体识别并结合病毒抗原，采用RT-PCR方法进行病毒特异基因扩增。优点：省去RNA提取的繁琐步骤，试验周期较短；成本较传统的RT-PCR的低，对仪器设备的依赖较传统的RT-PCR的低要小。对于病毒含量极低的样品，DOT-ELISA无法检测的样本。M1234567M：DNAmarker，（DL500Takara公司）泳道1-3采用P3/4引物扩增，4-7采用S10引物扩增。1、3、4为健康水稻；2、5、6、7为感SRBSDV水稻。贵州荔波：5月12日，迁入峰，白背飞虱，带毒率为0；贵州荔波：6月5日，荔波茂兰、朝阳等地，疑似病株，不带毒；贵州从江：6月，疑似病株，确认南矮；云南思甸：6月，疑似病株，确认南矮；云南元江：6月，疑似病株，确认南矮；广西植保总站：送检样品，确认南矮。湖南浏阳：待检；湖南江华：送检样品，不带毒；贵州天柱：待检。2011年南方水稻黑条矮缩病检测结果M1234567892011