DNA的复制和修复解析课件

DNA的复制和修复DNA的复制和修复1遗传的中心法则1958年Crick提出以DNA为中心的遗传信息的传递规律，即DNA贮存的遗传信息通过复制传给子代DNA，通过转录传给RNA，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为中心法则。DNARNA蛋白质复制复制转录翻译反转录？1970年Temin和Baltimore发现RNA病毒的RNA可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给cDNA，也可通过RNA复制或RNA转录传给子代RNA，这是对中心法则的补充。1997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向DNA传递。遗传的中心法则1958年Crick提出以DN2

复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。几个基本概念：

逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。

翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。

转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一3Reversetranscription中心法则图示Reverse中心法则图示4第一节DNA的复制第一节DNA的复制5复制：以亲代（母链）DNA为模板合成子代DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA一、DNA的复制复制：以亲代（母链）DNA为模板合成子代DNA的过程。复制亲6（一）DNA复制是半保留复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念（一）DNA复制是半保留复制DNA生物合成时，母链DNA解7半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素815N-DNA的密度大于14N-DNA的密度15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度9DNA的复制和修复解析课件10AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

ATCGATTAATAT+母链DNA复制过程中形成的复制叉11按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。半保留复制的意义按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子12（二）DNA复制的起点和方式

复制子：基因组能独立进行复制的单位叫复制子，每个复制子都含有控制复制起始的origin和终止复制的终点（terminus）。双向复制(bi-directionalreplication)、单向复制(unidirectionalreplication)；复制叉(replicationfork)或生长点(growingpoint)多复制子(multi-replicon)（二）DNA复制的起点和方式复制子：基因组能独立进13双向复制单向复制双向复制单向复制14DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）（细菌DNA复制叉移动速度50kb/min，大肠杆菌染色体完成复制需要40分钟，然而，大肠杆菌每20分钟即可分裂一次。如何解释？)真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）复制叉移动速度为1kb～3kb/min，高等真核生物一般复制单位长度为100～200kb，每个复制单位在30～60分钟完成复制，通常完成整个染色体复制的时间要用6～8h。一轮复制尚未完成，又启动新一轮的复制。DNA复制的主要方式大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制153不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链16三、半不连续复制

1、体内仅存在5’3’的DNA聚合酶

2、前导链与随从链（岗崎片段）三、半不连续复制17前导链滞后链冈崎片段前导链：DNA复制时，一股以3’5’方向的母链作为模板，新合成的链以5’3’方向连续合成的链称为前导链。滞后链：DNA复制时，一股以5’3’方向的母链作为模板，新合成链沿5’3’合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为随从链。复制方向与解链方向一致复制方向与解链方向相反冈崎片段前导链滞后链冈崎片段前导链：DNA复制时，一股以3’518

DNA半不连续复制：

3’5’方向母链为模板，新链5’3’方向连续合成5’3’方向母链为模板，新链5’3’方向合成许多不连续的片段（岗崎片段）这种复制方式称之为半不连续复制。

19RNA引物

DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP在DNA模板上聚合需要具3’-OH的引物RNA聚合酶能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合提供3’-OH引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去、补满，再由连接酶连接减少突变，提高DNA复制的真实性RNA引物

DNA聚合酶RNA聚合酶减少突变，提高DNA复制20四、与DNA复制有关的酶和蛋白质(一)DNA聚合酶：原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：53四、与DNA复制有关的酶和蛋白质(一)DNA聚合酶：21

3’5’5’3’外切酶聚合酶NC5’3’外切酶小片段大片段（klenow片段）切除RNA引物损伤修复校读功能（常用的工具酶）1、DNA聚合酶Ⅰ聚合功能3’5’5’322DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊Pol23(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。(三）DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口作用特点：T424HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’25(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）DNA解链酶单链结合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松开超螺旋使双链DNA解链稳定单链区合成RNA引物除去引物并填满缺口40065746010950300100300(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能261、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。1、拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变27DNA的复制和修复解析课件282、解螺旋酶（解链酶）

通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。3、单链结合蛋白：2、解螺旋酶（解链酶）通过水解ATP将DNA两条链打29引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。4、引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成

引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起30（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图31五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成链的延伸：五、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）复制的终止：复32复制原点oriC和原点的识别：DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。复制原点oriC和原点的识别：DNA的复制有特定的起始位点33（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白HU、ATP参与下，DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。34DNA的复制和修复解析课件35(二)链的延长（冈崎片段的合成）

真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp(二)链的延长（冈崎片段的合成）真核生物的冈崎片段为：36DNA链的延伸

在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。

前导链滞后链冈崎片段半不连续复制冈崎模型DNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-37冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:38(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。(三)复制的终止顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱Ter:终39(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、DNA的损伤修复系统。DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：(四)DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：40

四、DNA的损伤与修复

DNA修复的基础：一条链有损伤修复酶切除以未损伤的链为模板合成原来相同的序列

四、DNA的损伤与修复41DNA的复制和修复解析课件42（一）造成损伤的原因自发因素物理因素化学因素紫外线损伤（共轭双键）电离辐射损伤（X线/线）亚硝酸盐CU5-溴尿嘧啶5-BUA氮芥类烷化剂羟胺C-AGG羟胺（一）造成损伤的原因自发因素GG羟胺43（二）修复机制光修复

（低等生物）不需光复活酶需光复活酶（photoreactivationrepair）嘧啶单体嘧啶二聚体嘧啶单体嘧啶二聚体

光复活酶（+）

蓝光280nm239nm1、直接修复（二）修复机制光修复（photoreactivationr44光复活/光修复①光复活酶识别TT→与之形成复合物②吸收光能③使TT解开成为单体④酶从复合物中释放仅作用于UV形成的产物光复活/光修复45O6甲基鸟嘌呤直接被修复O6甲基鸟嘌呤直接被修复462、切除修复（excisionrepair）

（1）UV特异核酸内切酶切除DNA聚合酶Ⅰ填补、修复DNA连接酶连接（2）人体重要的修复方式，对多种损伤均能起修复作用。（3）缺乏UV特异核酸内切酶——着色性干皮病2、切除修复（excisionrepair）47切除修复发生在复制之前核苷酸切除修复切除修复发生在复制之前核苷酸切除修复48dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP胞嘧啶C自发脱氨氧化生成尿嘧啶U——尿嘧啶-N-糖苷酶腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤——次黄嘌呤-N-糖苷酶烷基化修饰的碱基被糖苷酶除去AP位点（apurinic/apyrimidinicsite）无嘌呤或无嘧啶位点dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP腺嘌呤脱氨成49碱基切除修复

DNA糖苷酶识别切除改变的碱基

核酸内切酶切除磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ填补DNA连接酶连接碱基切除修复DNA糖苷酶识别切除改变的碱基50DNA糖苷酶具特异性识别-----DNA中的异常碱基水解-----异常碱基与脱氧核糖间糖苷键使其脱落DNA的复制和修复解析课件51DNA的复制和修复解析课件52DNA碱基的组成为何是“T”？（1）DNA中的C容易突变成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U（3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常UDNA中T的存在增加遗传信息的稳定性RNA中的U：数量多/半衰期短/经济DNA碱基的组成为何是“T”？53碱基切除修复碱基切除修复54DNA损伤核苷酸切除修复DNA损伤核苷酸切除修复553、错配修复——耗能的过程3、错配修复56DNA的复制和修复解析课件57DNA的复制和修复解析课件58CH3GATC

CTAGGTGATC5´3´CTAG3´5´GTCH3CH3GATC

CTAGGTMutHMutSMutL切口CH3GATC

CTAGGT5´3´CH3

GATC5´3´

CTAG3´5´TGDNA解链酶核酸外切酶SSBdNMPsCH3GATC

CTAGGT5´3´DNA聚合酶DNA连接酶dNTPsCH3GATC

CTAGGCDNA错配修复的模型CH3GATCC59DNA的复制和修复解析课件604、重组修复（recombinationalrepair）

4、重组修复（recombinationalrepair）61①二聚体后起始途径——复制继续②子链缺口经重组由母链相应片段填补RecA蛋白具有交换DNA链活力③母链缺口再合成——二聚体可被切除修复，如未被去除，将随多次重组修复而逐渐稀释。复制后修复①二聚体后起始途径——复制继续复制后修复625、易错修复细胞DNA受到严重损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，能引起一系列复杂的诱导效应——SOS反应。SOS反应诱导的修复系统包括：避免差错的修复(如切除修复和重组修复）易错修复（诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶）5、易错修复细胞DNA受到严重损伤或复制系统受到抑制的紧急情63SOS反应诱导缺乏校对功能的DNApolⅣ、Ⅴ——引起校对系统的松懈RecA基因产物LexA蛋白自身水解（蛋白酶活性被激活）SOS系统开放：修复系统的酶表达LexA基因表达也增加使SOS反应可迅速逆转SOS反应诱导缺乏校对功能的DNApolⅣ、ⅤLexA基因表64DNA的复制和修复解析课件65SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。SOS反应造成大量的突变体。因此，SOS可能在生物进化中起重要的作用。大多数在细菌中诱导产生SOS反应的作用剂，对高等生物都是致癌的，因此，目前有关致癌物的一些简便的检测方法即是根据SOS反应原理设计而设计的。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，是生物在不利环境中求66五、DNA突变

（一）突变的类型点突变类型结果转换----同型碱基颠换----异型碱基启动子/剪接信号影响整个基因功能编码序列蛋白质功能改变中性变化AA变化，功能不变静止突变碱基变，AA不变1.碱基对的置换五、DNA突变

（一）突变的类型点突变1.碱基对的置换67缺失插入倒位一个碱基/一段核苷酸/整个基因一段原来没有的碱基/核苷酸序列DNA链内部重组，一段方向颠倒2.移码突变缺失一个碱基/一段核苷酸/整个基因2.移码突变68（二）诱发基因突变的因素

根据突变发生的原因可将突变分为:自然条件下未经人工处理而发生的——自发突变（spontaneousmutation）经人工处理而发生的突变——诱发突变（inducedmutaion）诱发突变的各种内外因素统称为：

诱变剂（mutagen）（二）诱发基因突变的因素69

HNNHOBroNNHOBr

OHHNNHOOCH