浙大生化实验一

专业：生物科学专业：生物科学姓名：学号：日期：地点：装订线课程名称：生物化学实验（甲）指导老师：成绩：__________________实验名称：蔗糖酶的提取及离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶实验类型：生化实验同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。2、学习离子交换层析的基本原理；3、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；4、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。二、实验内容和原理1、酵母细胞破碎本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。3、离子交换层析离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。4、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。三、实验材料与试剂1、实验材料市售干酵母粉10g/组，蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ2、实验试剂1、石英砂；2、95%乙醇(-20℃）；3、DEAE-SepharoseFastFlow(弱碱性阴离子交换剂)；4、20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液；5、20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3缓冲液；6、0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；7、5%蔗糖溶液；8、3，5-二硝基水杨酸试剂四、实验器材与仪器1、电子天平（称量样品）；2、研砵（每组一套）；3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；停止加入20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。9、洗脱：梯度洗脱法：加样后，用20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液进行平衡，洗脱流速为5ml/10min，洗去未被DEAE—SepharoseFastFlow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/LNaCl），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液和50ml含1mol/LNaCl的0.05ml/LTris-HClpH7.3缓冲液。洗脱流速为5ml/10min，每5ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），样品－20℃低温保存备用。10、蔗糖酶活力检测：收集活力高的蔗糖酶液，测总体积(ml数)（样品Ⅳ），-20℃保存空白对照样品管0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.51.5ml1.4ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸馏水1.0ml0.9ml分离纯化样品溶液/0.1ml50℃水浴8min3.5－二硝基水杨酸试剂1.0ml1.0ml100℃水浴5min观察颜色六、实验数据记录和处理1.、V1=22.5ml，V2=18.5ml，V3=6.5ml，2、核酸蛋白检测仪波形图其中，从左至右第一个峰并未检测出蔗糖酶，第二个大峰所在处收集的溶液检测出蔗糖酶，故收集第二个大峰对应的试管里面的液体。七、实验结果与分析由图1、图2曲线的不同分布可以看出：当蛋白质含量最高时，蔗糖酶的含量并非最高。这说明在样品Ⅱ中存在其他蛋白质类的杂质。试管号为7、8、9（即F4-7、