典型药物生产工艺-维生素C的生产工艺

学习情境三维生素C的生产工艺一、维生素类药物1、基本概念维生素是生物体内一类量微、化学结构各异，具有特殊功能的小分子有机化合物，它们大多需从外界摄取。第一节概述2、维生素的特点①维生素不是构成机体组织和细胞的组成成分，它也不会产生能量，它的作用主要是参与机体代谢的调节。②大多数的维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须经常通过食物中获得。③人体对维生素的需要量很小，日需要量常以毫克（mg）或微克（μg）计算，但一旦缺乏就会引发相应的维生素缺乏症，对人体健康造成损害。

维生素分为脂溶性和水溶性两大类。脂溶性：维生素A，D，E，K等。水溶性：维生素B1、B2、B3（烟酸）、B5（泛酸）、B6、B7、B9（叶酸）、B12、维生素C等。

维生素A

——夜盲症、干眼症、视神经萎缩等，还会引起皮肤干燥粗糙，抵抗力弱，头发干燥，指甲易断裂等症状，还容易造成抵抗力弱，易生病；维生素B1

——神经炎、脚气病、魏尼凯氏失语症等，还可引起便秘、消化不良，注意力不集中、健忘，肌肉疼痛无力，情绪不稳定，食欲减退，容易疲倦等；维生素B2

——脂溢性皮炎、口腔炎，长青春痘，头发分叉断裂，指甲断裂，眼睛布满血丝等；维生素B3

——失眠、口腔溃疡、癞皮病，皮肤炎、红疹、脱皮，食欲差、腹泻，精神紧张、躁动不安，易疲倦，皮肤粗糙易产生皱纹等；维生素B5

——忧郁、焦虑，肌肉容易抽筋，失眠、容易疲倦，头发容易枯黄断裂，食欲不振、消化不良、十二指肠溃疡，手脚末梢有刺麻感等；

维生素B6

——肌肉痉挛、过敏性湿疹，暴躁易怒，经前症候群，皮肤炎，情绪不稳定，贫血等；维生素B9

——恶性贫血；维生素B12——恶性贫血，记忆力减退，月经不调，肌肉无力，胃肠障碍，食欲不振、体重减轻；维生素C

——坏血病；维生素D

——软骨病（佝偻病）；维生素E

——不育症、习惯性流产等；维生素K

——凝血酶缺乏，不易止血，胃肠不适，严重腹泻等二、维生素C的发现1497年7月9日到1498年5月30日，葡萄牙航海家达伽马发现绕过非洲到达印度的航线，他的160个船员中，有100多人死于坏血病。1519年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南美洲东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床破裂了，有的船员流鼻血，有的船员浑身无力，待船到达目的地时，原来的200多人，活下来的只有35人，人们对此找不出原因。1536年法国探险家在发现圣劳伦斯河之后，溯流而上抵达魁北克过冬。探险队中24人死于坏血病，其它多人也都病重。有一位印第安人教他们饮用一种arborvitae树叶泡的茶，就治好了这些人。后来发现这种树的叶子里每100克含有50毫克的维生素C。1734年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重的坏血病，当时这种病无法医治，其它船员只好把他抛弃在一个荒岛上。待他苏醒过来，用野草充饥，几天后他的坏血病竟不治而愈了。诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万水手的生命。1747年英国海军医官詹姆斯·林德在船上做了这个现在很著名的实验，12个严重的坏血病海员，大家都吃完全相同的食物，唯一不同的药物是当时传说可以治疗坏血病的药方。两个病人每天吃两个橘子和一个柠檬，另两人喝苹果汁，其它人是喝稀硫酸，酸醋，海水，或是一些其它当时人认为可治坏血病的药物。6天之后，只有吃新鲜柑橘水果的两人好转，其它人病情依然。经过长期的研究，科学家后来从新鲜的水果和蔬菜中提取出维生素C（又叫抗坏血酸），并证实坏血病就是维生素C缺乏症。三、维生素C的特点（必需维生素的特点）1、调节性维生素类是天然食物中的一种成分，不能供给能量，也不是组织细胞的结构成分，是一种活性物质，对新陈代谢起调节和整合作用。2、微量性成人每天需摄入50～100mg。过量症状：腹泻。3、外源性人体内不能合成，必须从外界摄取。1907年挪威化学家霍尔斯特在柠檬汁中发现，1932年才获得纯品，现已可人工合成。主要食物来源：柑桔类水果、蔬菜等。4、特异性缺乏症状：坏血病。能够治疗坏血病并且具有酸性,所以称作抗坏血酸。四、维生素C结构与性质维生素C，维他命C，L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素。分子式：C6H8O6；分子量：176.13g/mol；外观：无色晶体；熔点：190-192℃；紫外吸收最大值：245nm；维生素C(多羟基不饱和内酯衍生物)分子中有两个手性碳原子，故有4种光学异构体，其中L-抗坏血酸效果最好，其他三种临床效果很低或无效。D-甘油醛

L-甘油醛

理化性质：1、水溶性本品易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿和石油醚等有机溶剂。2、酸性水溶液显酸性反应。3、还原性本品结晶体在干燥空气中较稳定，但其水溶液能被空气中氧和其它氧化剂所破坏，故贮藏时要阴凉干燥，密闭避光。4、水解性

水溶液在pH5-6之间稳定：若pH值过高或过低，并在空气、光线和温度的影响下．可促使内酯环水解．并可进一步发生脱羧反应而成糠醛，聚合后易变色。这是本品在贮存中变色的主要原因。水解反应过程如下。四、维生素C生产现状维生素C是目前全球维生素生产厂家竞争最激烈的一块，也是中国企业直接加入并具有相当实力的一块。市场格局可谓三足鼎立，即罗氏公司、巴斯夫公司和中国4家公司，具有明显优势的是前两者，罗氏的市场份额达到40％，而巴斯夫在兼并日本武田的维生素C销售网络后，市场份额达到28％，剩余约30％的市场由包括中国4家企业（国内维生素C四巨头---东北制药、石药维生药业、华药维尔康药业和江苏江山药业。这四家企业目前总产量接近10万吨，占据了国内市场90%以上的份额），出口量占87%，在国际市场上占据着一半以上份额。

现在中国已经掌握了维生素C生产的领导地位，应该可以彻底解决病毒的问题，只是出产的维生素C大部份都外销，中国人服用维生素C的平均剂量，远逊于欧美和日本。如果我们普遍认识到维生素C预防和治疗病毒传染病症的原理并且按量服用，就可以预防很多病毒的传播。维生素C的真正效用，会显示在治疗禽流感，SARS和AIDS等更严重的病毒传染病上。

在19世纪30年代以前，VC是从柠檬中提取的，价格昂贵，远不能满足人们的需要。第二节合成路线一、莱氏法1933年德国莱奇司登（Reisehstein）等用化学合成法制备VC获得成功，后1935年进一步改进为由一步发酵和化学合成来生产VC，即以D-山梨醇为原料，经黑醋菌一步发酵得L-山梨糖，再经丙酮酮醇缩合、次氯酸钠氧化及盐酸转化等5步制备维C获得成功。此方法通称为莱氏法

。这个方法的专利权在1934年被罗氏公司购得，成为50余年来工业生产维生素C的主要方法。是目前世界各国生产维生素C普遍采用的路线。罗氏公司也因此独占了维生素C的市场。

莱氏法制备维生素C合成路线L-山梨糖目前国外几家主要的生产VC的公司都采用此方法。优点工艺成熟、产品质量好生产周期短，总收率高（66%）缺点工序多，耗用原料多有易燃易爆有机溶剂对劳动保护和安全生产要求高本法以微生物氧化代替化学氧化，简化原有的莱氏法生产工序。是中国的创新技术。1980，是中国第一个拥有自主知识产权的工艺技术。大幅改进了Reichstein的一步发酵法，减低维生素C的生产成本。此法先将葡萄糖还原成为山梨醇，经过第一次细菌发酵成为山梨糖，再经过第二次细菌发酵转化为KGA（2-keto-gulonicacid），最后异化成为维生素C。这项专利的国际使用权于1985年出售给瑞士罗氏公司，是当时中国对外技术转让中最大的项目。罗氏得到了专利但是并不使用，仍然沿用旧有的Reichstein的一步发酵法。它的目的是要防止其它外国公司使用新法与其竞争。这项专利在中国的国内使用权并没有卖断给罗氏公司，到了1990初期中国国内成立了26家药厂用二步发酵法生产维生素C。

二、两步发酵法--简化缩短的莱氏法L-山梨糖优点缩短工序降低了原料成本节约了大量有机溶剂，减少了“三废”多数是液体物料，有利于机械化和自动化生产缺点总收率较低（45-48%）发酵单位体积产率低（60mg/100mL）设备体积大，能耗大目前维生素C的工业生产不论是Reichstein-Grussner发明的“莱氏合成法”，还是我国提出的“二步发酵法”，都是以D-葡萄糖高压加氢转化生产的山梨醇为原料，生产维生素C前体一2-酮基-L-古龙酸。由于需要先将葡萄糖高压加氢制备，给大规模生产带来障碍。如能直接从葡萄糖开始发酵和制备Vc，就可避免上述问题，带来巨大经济效益。

三、全化学合成法三步全化学合成法目前仅见少量报导，尚未发现投入生产。其合成路线是将葡萄糖或葡萄糖醛酸内酯丙酮化后，经催化、氧化，然后水解还原成维C。1、单酮葡萄糖法以葡萄糖为原料的全合成法据报道氧化一步收率70%，还原一步收率40%--50%,，优点是从葡萄糖起仅三步反应，简化了工艺，缩短了周期，是目前已知的工艺路线中最短的。缺点是丙酮用量大，且须要耗用价值昂贵的钠硼氢和氧化铂，如能找到其他工艺方便成本低廉的还原方法，则更为理想。2、葡萄糖醛酸内酯法以葡萄糖醛酸内酯为原料，三步合成维生素C。日本1974年发表。收率比单酮葡萄糖法有所提高，且避免了用铂，有其优越性，且为维生素C用化学合成法创一新路，值得进一步探索。四、其他方法1、2-5-二酮基-D-葡萄糖酸法以葡萄糖为原料的两步发酵法（新两步发酵法）此法总转化率很高，可达84.6%。虽然研究很成功，但未见工业化研究的报道。但是为进一步开展基因工程菌法（一步发酵法）奠定了基础。2、基因工程菌法（一步发酵法）用构建的基因工程菌使欧文氏菌属和棒状杆菌属两种菌彼此相关的特性结合到一株菌中，直接从葡萄糖只需一步发酵便可生产2-酮基-L古龙酸。但此法应用于工业生产收率较低，尚无进一步报道。第三节生产工艺原理和过程一、莱氏法生产维生素C的工艺原理和过程L-山梨糖D-山梨醇的制备L-山梨糖的制备2,3,4,6-双酮基-L-山梨糖（双丙酮糖）的制备2,3,4,6-双酮基-L-古龙酸（双丙酮古龙酸）的制备粗品维生素C的制备粗品维生素C的精制1、D-山梨醇的制备(1)工艺原理

D-山梨醇是己六醇化合物，含有4个手性碳原子，具有D-葡萄糖的构型，故可将D-葡萄糖上的C-1上的醛基还原成醇基而制得。但是D-葡萄糖在受热，或与碱、吡啶作用后，端基C-2的手性碳原子的构型可以发生差向异构化而形成D-甘露糖，再还原而得D-甘露醇。因此反应产物是D-山梨醇和D-甘露醇的混合物，要控制甘露醇的量。工业生产中都是采用D-葡萄糖催化氢化的方法制备D-山梨醇。控制压力、氢作还原剂、镍作催化剂3.8-4.0MPa（2）工艺过程在70-75℃下加水溶解葡萄糖，50%溶液加活性炭搅拌，滤去碳渣，用石灰乳液调节pH8.4氢气纯度≥99.3%、压强<0.04MPa时，将糖液冲入釜内加入活性镍催化剂通蒸汽，并搅拌温度升至120-135℃时关闭蒸汽控制温度在150-155℃，压强3.8-4.0MPa反应至不吸收氢气为反应终点0.2-0.3MPa压强下压料至沉淀缸、过滤、树脂交换、活性炭处理减压浓缩，得到含量60-70%的D-山梨醇，无色透明或微黄色透明粘稠液体，收率约95%1、D-山梨醇的制备（3）反应条件及影响因素pH值葡萄糖水溶液pH8.0-8.5偏高或偏低会使甘露醇（副产物）含量增加如果pH过高或过低，将会使甘露醇的含量增加，尤其是pH>10时，甘露醇含量直线上升。在规定的pH范围内如果使用催化剂活性良好，则所得山梨醇中甘露醇含量极低。设备材质山梨醇能溶解多种金属避免使用铁、铝或铜制设备，而用不锈钢副产物影响（比旋度控制在+5.50º）甘露醇影响产物比旋度纯山梨醇的比旋度为-2.0°，纯甘露醇为-0.49°。实际测定时，加入硼砂，使其分别与山梨醇和甘露醇形成了络合物，前者比旋度为+4.0°，后者比旋度为+23.4°。根据测定的比旋度可以计算所含甘露醇的量。氢化速度快，反应时间短，可以减少甘露醇的生成量。残糖含量影响产物比旋度——氢化反应的终点指标葡萄糖（比旋度为+53°）的存在对比旋度的影响比甘露醇大2倍，因此氢化反应必须完全，尽可能减少残糖量（还原糖）。残糖含量既是氢化终点指标。1、D-山梨醇的制备（4）注意事项及三废处理车间进行还原反应时氢气自制，故配有氢气柜。应杜绝火源，以免氢气发生爆炸废镍催化剂可压制成块，冶炼回收再生废液中的镍经沉淀后可回收废酸、废碱经中和后放入下水道莱氏法生产维生素C的工艺原理和过程复习L-山梨糖NaClONiSO4.7H2O2、L-山梨糖的制备（1）工艺原理选择性地使C2位的羟基氧化成羰基生物氧化黑醋菌作为生物氧化剂*发酵制药概念利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化，获得药品的过程发酵制药的基本过程菌种选育发酵工段提炼工段成品工段孢子制备种子制备发酵控制预处理分离提取浓缩纯化成品工段包装原料药实验室、种子库发酵车间提炼车间包装车间2、L-山梨糖的制备（2）工艺过程菌种部分--菌种是发酵工业生产的关键！试验得到黑醋菌为D-山梨醇最有效的生物氧化剂黑醋菌是一种小短杆菌，属革兰氏阴性菌（G-），生长温度为30~36℃，最适温度为30~33℃。向菌种保藏机构索取有关的菌株。菌种来源的途径中国典型培养物保藏中心:ChinaCenterforTypeCultureCollection(CCTCC)。中国普通微生物菌种保藏管理中心：ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter(CGMCC)，微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：2.

从一些发酵制品中分离目的菌株。容易筛选到较理想的菌株。

3.

由自然界采集样品中获得。如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。容易发现新的菌株资源。菌种保藏菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养：缺乏）菌种保存方法菌株分离与筛选菌株分离(separation)：是将样品（如土壤、海洋、堆肥等）中混杂生长的各种微生物通过分离技术区分开，获得所需微生物的过程。菌株筛选(screening)：在目的菌株分离的基础上，结合常规生产性能测定，选择目的产物合成能力相对高的菌株的过程。稀释涂布法菌种选育——自然选育（1）不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。（1）菌种的提纯复壮。（2）防止退化，稳定生产水平。1年1次。

过程菌种单孢子平板分离单菌落测活优良菌株效率低,增产幅度小菌种选育——诱变育种（2）人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。生物类：噬菌体，转座子。特点：快速，简单，效益大。缺点：无定向性。菌种选育——杂交育种（3）两个不同基因型的菌株，通过结合或原生质体融合，使遗传物质发生重新组合，从中分离筛选出具有优良性状的新菌株。

特点：有一定的定向性。将黑醋菌保存于斜面培养基中，每月活化传代一次，保存于0~5℃冰箱内。斜面培养基中菌种活化传代24h后，产糖量达到100mg/mL。划试管斜面在30℃培养48h，镜检菌体正常、无杂菌，即可接入生产。菌种活化菌种复苏方法从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。菌株活化：在无菌操作下用无菌微量吸管，从已溶解的菌液，滴入固态指定培养基，以划线法接种于培养基。将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养，挑选培养基茁壮的菌落接种到新的培养基培养，重复2-3次。种子扩大培养发酵部分投料。D-山梨醇浓度为16%-20%培养基（酵母膏、碳酸钙、琼脂、磷酸盐、硫酸盐等）控制pH5.4-5.6，120℃灭菌0.5h通入无菌空气在发酵罐中培养（温度30-32℃；压力0.03-0.05MPa）一级种子罐发酵率40%以上，二级种子罐发酵率50%以上发酵培养基制备概念供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。培养基的成分碳源氮源无机盐水生长因子前体与促进剂消泡剂1、碳源(carbonsources)概念：构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。碳源种类糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸2、氮源（nitrogensources）概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：无机氮源、有机氮源有机氮源几乎所有微生物都能利用有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、尿素。无机氮源氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。（NH4）2SO4利用后，产生硫酸生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。3、无机盐和微量元素概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。种类：盐离子磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。4、水菌体细胞的主要成分。营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。培养基的主要成分之一。5、生长因子（growthfactor）概念：维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。种类：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般无需添加。营养缺陷型菌株：必需添加。6、前体(precursor)概念：加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大的变化。使用：添加前体是提高抗生素产量的重要措施。多次少量、连续流加的工艺。7、促进剂(accelerant)概念：促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。种类：氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。8、消沫剂（defoamingagent）概念：降低泡沫的液膜强度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。种类：表面活性剂，低表面张力。天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。培养基灭菌的操作方式(1)分批灭菌操作，间歇灭菌,实罐灭菌：配制好培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度。特点：不需其他的附属设备，操作简便，手动。缺点：加热和冷却时间较长。营养成分损失较多，罐利用率低。适合小批量生产规模。分批操作的灭菌过程分批灭菌的操作过程通入蒸汽：空气管、夹套通入蒸汽。加热升温：70℃，取样管、放料管通入蒸汽。维持保温：120℃，罐压0.1MPa，排气。调节进汽和排气量，维持30min。冷却降温：依次关闭排气、进汽阀。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温。（2）连续灭菌操作高温短时灭菌操作，连续：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由不同的设备执行：加热器，保温设备，冷却器。（2）连续灭菌操作－流程图

培养基与高压蒸汽直接混匀，达到灭菌温度（130－140℃）（2）连续灭菌－操作过程配料：配料罐，配制培养基。预热罐：定容和预加热。70－90℃。加热器：培养基与蒸汽混合，快速升到130－140℃。维持罐：维持灭菌时间,5－7分钟。冷却管：培养基经过冷却水管冷却。40－50℃。输入灭菌的发酵罐中。连续灭菌的特点1）高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少2）热能利用合理，易于自动化控制；3）不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌；4）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。5）对压力要求高，一般为0.45-0.8MPa。空气除菌操作工艺发酵对空气的要求好氧微生物需要氧气供应，通入空气。连续一定流量的压缩无菌空气。压强：0.2-0.4MPa。空气质量：相对湿度小于70％；比培养温度高10－30℃；洁净度A级。工业制备大量空气的方法加热灭菌：空气在进入培养系统之前，一般需用空压机以提高压力，所以空气热灭菌时所需温度的提高，可直接利用空气压缩时的温度升高来实现.静电除菌：静电除尘是利用静电引力来吸附带电离子而达到除尘灭菌的目的。悬浮于空气中的微生物、微生物孢子大多数带有不同的电荷，没有电荷的微粒进入高压静电场时则会被电离成带电微粒，但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗运动的动量时，微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘对很小的微粒效率较低。介质过滤：是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。发酵部分发酵培养的山梨醇的投料浓度为25%当发酵率在95%以上时，温度略高（31-33℃）；pH7.2左右，即为发酵终点控制真空度在0.05MPa以上，温度60℃以下，减压浓缩结晶即得L-山梨糖发酵罐-用于培养微生物或细胞的封闭容器或生物反应装置。

2、L-山梨糖的制备（3）反应条件及影响因素①山梨醇的纯度和残糖量影响氧化收率。山梨醇纯度越高，残糖量越小，收率越高。②氧化速率与山梨醇浓度有关。山梨醇浓度不能过高和过低。③金属离子的存在抑制细胞活性。因此要控制发酵液中金属离子的浓度，另外不锈钢材质的设备。④适当加生物氧化剂，可提高发酵率。⑤空气流量控制在一定范围（0.7-1VVM）。一般越大越好，但是过大，动力消耗太大，对设备的要求严格。⑥细菌的接种量对氧化速率有显著影响。接种量较大时，可显著提高提高发酵率。2、L-山梨糖的制备（4）注意事项尽量减少染菌途径其途径有种子或发酵罐带菌接种时罐压低于大气压培养基消毒不彻底操作中染菌阀门泄露空气分布管腐蚀，易造成死角：管道内结垢，易消不透染菌3、双丙酮糖的制备（1）工艺原理通过丙酮酮化保护保护2位酮基，3，4，5位羟基不被氧化。（2）工艺过程配料比L-山梨糖：丙酮：发烟硫酸：氢氧化钠=1:9:0.4:0.6步骤5℃下压入丙酮、发烟硫酸，加入山梨糖15-20℃下溶糖6h降温至-8℃，保持6-7h得酮化液。<25℃，加入18%-22%的氢氧化钠溶液，中和至pH8.0-8.5下层硫酸钠用丙酮洗涤，回收单丙酮糖上层清液常压蒸馏至100℃，减压蒸馏至90℃为终点苯提取蒸馏后剩余溶液，减压蒸馏得双丙酮糖收率88%（3）反应条件及影响因素缩酮化反应有多种副产物-温度高、水分多、时间过长、硫酸过多则副反应增多，双酮糖收率降低酮化反应温度—低温-低于20℃-高于20℃将有利于单酮糖的生产，收率降低酸度--碱性-中和至pH为8.0-8.5，双酮糖在酸性条件下不稳定。3、2,3,4,6-双酮基-L-山梨糖的制备（4）注意事项双酮糖在酸性中不稳定，碱性中较温定。因此中和时，必须保持碱性和低温条件3、2,3,4,6-双酮基-L-山梨糖的制备4、双丙酮古龙酸的制备（1）工艺原理氧化剂---NaClO催化剂---NiSO47H2O（2）工艺过程次氯酸钠的制造——新鲜配制反应釜内加入14.5%-15.5%的氢氧化钠溶液，通入液氯，搅拌（转速不宜过高）以有效氯浓度9.5-9.7%，余碱浓度2.8-3.2%为终点双丙酮酸的氧化配料比双丙酮糖：次氯酸钠：硫酸镍=1：10：0.04投料，40℃保温搅拌30min静止片刻，抽滤滤液冷至0-5℃，用盐酸中和（pH7、3、1.5）过滤、水洗、过滤。得结晶，收率86%。（1）工艺原理5、粗品维生素C的制备-酸转化2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）（2）工艺过程配料比2-酮基-L-古龙酸：38％盐酸：丙酮＝1：0.4(W／V)：0.3(W／V)先将丙酮和一半古龙酸加入转化罐，搅拌再加入盐酸和余下的古龙酸蒸汽加热，升温至30-38℃，关闭蒸汽，自然升温至52-54℃，保温5h达到反应高潮，保持温度50-52℃，至总反应时间20h，冷却过滤、冷乙醇洗涤，得维生素C粗品，收率88%③转化

（3）反应条件及影响因素盐酸浓度38%若盐酸浓度偏低，则转化不完全，收率低若盐酸浓度偏高，则分解成许多杂质，使反应物颜色较深丙酮的影响酸性条件下，产物容易分解为糠醛，进一步聚合成水和醇不溶的糠醛树脂。加入丙酮可以溶解糠醛，降低其活性而阻止其聚合加料的先后顺序先加丙酮，使之与双丙酮古龙酸形成一种悬浮液，易搅拌。析出温度的影响析出温度555656.5575859析出温差122.5345收率%74.882.382.7828180.5析出期为转化反应的剧烈期析出期温差太小，为1℃，说明反应不剧烈，放热小，不完全温差太大，为5℃，则反应放热太多，反应太剧烈，热量不能很快传递出去，加速副反应发生，严重时会引起烧料最佳温差2.5℃，析出温度不能高于59℃如遇突然停电，应选关蒸汽，后关搅拌来电后，先开搅拌，后开蒸汽，缓慢升温6、粗品维生素C的精制配料比粗维生素C(折纯)：蒸馏水：活性炭：乙醇=1：1.1:0.06:0.6步骤粗品（85%）真空干燥（50-55℃，20-30min）除去挥发性杂质（盐酸、丙酮）投入热水（68-70℃）中溶解加入活性炭搅拌5-10min保温压滤结晶罐中降温至45-50℃6、粗品维生素C的精制加入晶种，缓慢冷却至-2℃，结晶晶体离心甩滤，冰乙醇洗涤甩滤，低温干燥（43-45℃，1.5h）得精制维生素C（m.p.190-192℃）收率91%总收率60%（对D-山梨醇计）莱氏法生产维生素C的工艺原理和过程复习L-山梨糖NaClONiSO4.7H2O二、两步发酵法生产维生素C的工艺原理及过程D-山梨醇的制备2-酮基-L-古龙酸的制备（两步发酵）L-山梨糖的制备（第一步发酵）2-酮基-L-古龙酸的制备（第二步发酵）粗维生素的制备维生素C的精制L-山梨糖3、2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)的制备（1）工艺原理微生物氧化法---氧化葡萄糖酸杆菌(小菌)-假单胞杆菌或芽孢杆菌(大菌)作为生物氧化剂提取---离子交换法假单胞菌

芽孢杆菌1）实验室菌种制备将保存于冷冻管的假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌菌种活化，分离及混合培养后移入三角瓶种液培养基中，在29-33℃振荡培养24h，产酸量在6-9mg/ml，pH值降至7以下，菌形正常无杂菌，再移入血清瓶中，即可接入生产。（2）工艺过程2、种子培养液制备先在一级种子培养罐内加入经过灭菌后的辅料（培养基：玉米浆、尿素及无机盐）和醪液（折纯含山梨糖1%）；控制温度为29-30℃，发酵初期温度较低，通入无菌空气维持罐压为0.05MPa，pH6.7-7.0，至产酸量达合格浓度，且不再增加时，接入二级种子罐培养，条件控制同前；作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开始产生2-酮基-L-古龙酸，直到完全形成芽孢和出现游离芽孢时，产酸量达高峰（5mg/ml以上）为二级种子培养终点。3、发酵罐发酵供发酵罐用的培养基经灭菌冷却后，加入至山梨糖的发酵液内，接入第二步发酵菌种的二级种子培养液，在温度30℃，通入无菌空气下进行发酵；为保证产酸正常进行，往往定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调pH值，使保持7.0左右。当温度略高（31-33℃），pH在7.2左右、二次检测酸量不再增加，残糖量0.5mg/ml以下，即为发酵终点，得含古龙酸钠的发酵液。此时游离芽孢及残存芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片，用显微镜观察已无法区分两种细菌的差别，整个产酸反应到此也就结束了。所以，根据芽孢的形成时间来控制发酵是一种有效的办法。在整个发酵期间，保持一定数量的氧化葡萄糖酸杆菌（产酸菌）是发酵的关键。

影响发酵产率的因素主要有以下几点：①山梨糖初始浓度在一定的温度（30℃）、压力（表压0.05Mpa）和pH（6.7~7.0）和溶液氧浓度（10%~60%）下存在一个极限浓度，此极限浓度为80mg/ml。当山梨糖浓度大于该浓度时，将抑制菌体生长，表现为产酸前期长，产酸速率变小，使发酵产率下降。从生产角度考虑，希望得到尽可能高的酸浓度，也即要求山梨糖初始浓度越高越好。因此，较适宜的初始浓度为80mg/ml左右。在产酸中期，菌体生长正常时，高浓度的山梨糖对发酵收率影响不大。因此，在发酵过程中滴加山梨糖或一次补加山梨糖均能提高发酵液中产物浓度。②溶氧浓度在发酵过程中，溶氧不但是菌体生长所必需的条件，而且又是反应物之一。在菌体生长阶段，高溶氧能使菌体很好地生长，而在中期，则应控制一定的溶氧浓度以限制菌体的过度生长，避免过早衰老，从而延长菌体的生产期。中期溶氧浓度越高，产酸速率越大，但产酸中期越短，这对整个发酵过程是不利的。因此，生产上一般前期处于高的溶氧状态；中期溶氧以3.5-6.0mg/ml为宜；后期耗氧减少，大多数情况下溶氧浓度会上升。③pH值发酵过程中如pH降至6.4是不利的，如能通过连续的调节使pH维持于6.7-7.9间对发酵是有利的。.3、提取部分一次交换盐酸酸化，调菌体蛋白等电点，沉降4h以上上清液以2-3m3/h的流速压入阳离子交换柱当流出液pH为3.5时，收集交换液，控制pH交换完，纯水冲柱蛋白质和氨基酸一样都是两性电解质。调节蛋白质溶液的pH值，可使蛋白质分子侧链或末端携带不同的电荷；在某一pH时其分子中的正电荷与负电荷数目相等，即净电荷为零，该pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度往往较低容易沉淀析出。加热过滤合并流出液和洗液调pH至蛋白等电点加热至70℃，加0.3%活性炭升温至90-95℃，保温10-15min，使蛋白凝结停止搅拌，快速冷却，高速离心二次交换上清液打入二次交换柱洗脱，至流出液pH=1.5时，收集交换液控制pH1.5-1.7之间。交换完毕，洗柱减压浓缩二次交换液进行一级浓缩控制真空度、内温，至浓缩液的相对密度达1.2出料同样条件二次浓缩，至尽量干加少量乙醇，冷却结晶甩滤，冰乙醇洗涤得2-酮基-L-古龙酸（m.p.158-162℃）收率80%②提取

三、维生素C粗品的制备（③转化）由2-酮基-L-古龙酸转化为L-抗坏血酸需经过转化，因使用催化剂的不同，可以分为酸转化、碱转化、酶转化。1、酸转化（莱氏法）2、碱转化（1）工艺原理+Na2SO4（2）工艺过程①