细胞分离和细胞培养课件

细胞分离和细胞培养细胞分离和细胞培养1.细胞分离（cellseparation）(1)制备单一细胞悬液组织

EDTA细胞间连接

消化

胰酶细胞外基质多细胞悬液1.细胞分离（cellseparation）(1)制备(2)分离不同类型细胞A.离心（centrifugation）

大小密度形状

小轻不规则大重圆形(2)分离不同类型细胞A.离心（centrifugatB.细胞的黏附性C.亲和性表面①②

轻微震荡消化基质B.细胞的黏附性C.亲和性表面①②轻微震荡D.流式细胞仪(flowcytometer,FCM)

荧光激活细胞分选仪（FACS）

原理：

用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中选出标记细胞。D.流式细胞仪(flowcytometer,FCM)

应用：细胞分选:1cellin10005000cells/sec应用：细胞分离和细胞培养课件E.激光捕捉显微切割技术

(Lasercapturemicrodissection,LCM)原理：应用：从组织切片中获取单一细胞E.激光捕捉显微切割技术

(Lasercapturem2.细胞培养（Cellculture）从活体组织分离出特定细胞,在一定的条件下进行培养,使之能够继续生存、生长以至增殖的一种方法。

invivo：用动物做实验

invitro：用培养细胞做实验

2.细胞培养（Cellculture）细胞分离和细胞培养课件(1)细胞培养的条件A.固体表面B.培养基、血清C.无菌、抗生素D.37℃、5％CO2

、95～100％湿度

(1)细胞培养的条件A.固体表面(2)细胞培养的不同阶段

原代培养(primaryculture)

传代培养(secondaryculture)传代细胞系（Cellline）成功筛选细胞株（cellstrain）(2)细胞培养的不同阶段传代细胞系（Cellline）成功原代培养(primaryculture):直接从生物体获取细胞进行培养。传代培养(secondaryculture)：将原代培养的细胞连续以一定比例扩大培养。细胞系(cellline)：原代培养细胞成功传代即为细胞系。细胞株（cellstrain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。原代培养(primaryculture):直接从生物体获取

功能：保持原分化特性形态：多不保持原有细胞形态成纤维样细胞上皮样细胞培养细胞的特点：功能：保持原分化特性培养细胞的特点：（１）变异细胞

可无限增殖、传代

细胞系（NIH3T3:1963年由小鼠成纤维细胞建立）接触抑制:细胞系在固体表面生长繁殖,在互相接触后,即培养皿长满一单层细胞后停止分裂、增殖。细胞系的来源：（１）变异细胞细胞系的来源：

（２）由癌细胞建立的“癌细胞系”

特点:可在培养皿中以极高的密度增殖，没有扩展的余地时,可向空间生长。（３）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系”肿瘤病毒放射线化学致癌物用癌基因转染正常细胞（２）由癌细胞建立的“癌细胞系”(3)细胞克隆（Cellcloning）克隆（clone）：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。

群体培养（massculture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层；

克隆培养（clonalculture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。(3)细胞克隆（Cellcloning）克隆（clone）(4)细胞融合(4)细胞融合①定义在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。①定义在自然或人工条件下，使二个或二个以

生物学方法：仙台病毒化学方法：PEG(聚乙二醇)

物理方法：电脉冲打孔仪②促融方法②促融方法③应用A.细胞核和细胞质间的相互作用

鸡红细胞组织培养细胞融合红细胞开始合成RNA,并进行DNA复制③应用A.细胞核和细胞质间的相互作用细胞周期相关因子的发现细胞周期相关因子的发现B.膜蛋白流动性C.基因定位B.膜蛋白流动性C.基因定位D.单克隆抗体制备

（monoclonalantibody）

单一的抗原一个B淋巴细胞特异性抗体单克隆抗体定义:

从单个B淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫单克隆抗体。D.单克隆抗体制备

（monoclonalantibody制备过程：1984年Nobel奖

B淋巴细胞＋“不死的”小鼠骨髓瘤细胞

杂交细胞（杂交瘤）

B淋巴细胞(产生特异性抗体)

肿瘤细胞(在体外无限增殖)将每个杂交瘤细胞分别增殖，就得到很多单一细胞的克隆，一个克隆可以产生一种特异性单克隆抗体。制备过程：1984年Nobel奖B淋巴细胞＋“不死的”细胞分离和细胞培养课件三、细胞组分的分级分离三、细胞组分的分级分离1.超速离心—

细胞器、大分子

1.超速离心—细胞器、大分子制备细胞匀浆细胞匀浆液膜细胞器大分子

方法：●低渗透压●超声振荡●在细胞膜上打孔●强制通过微孔●机械破碎或研磨制备细胞匀浆细胞膜方法：●低渗透压细胞分离和细胞培养课件⑴.差速离心法:用于分离大小、形状显著不同

的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离.⑴.差速离心法:用于分离大小、形状显著不同

的组分⑵.速度沉降用途:分离密度相近而大小形状略有差异的组分原理：制备梯度离心介质,分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。梯度特点:梯度平缓，密度较低(5%-20%)，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。分离效率:取决于沉降系数间的差异。⑵.速度沉降用途:分离密度相近而大小形状略有差异的组分细胞分离和细胞培养课件细胞分离和细胞培养课件⑶.平衡沉降用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。

原理：制备梯度离心介质，样品各成分在梯度介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。特点：介质密度高，陡度大(20%-70%）介质最低密度大于被分离组分的最大密度。分离效率:取决于浮力密度间的差异。⑶.平衡沉降用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。细胞分离和细胞培养课件细胞分离和细胞培养课件2.非细胞体系由分级分离得到的具有生物功能的细胞抽提物。

举例：

1.线粒体、叶绿体

2.内质网

3.蛋白质合成体系2.非细胞体系由分级分离得到的具有生物功能3.层析—

分离蛋白质(1)分配层析纸层析薄层层析3.层析—分离蛋白质(1)分配层析⑵柱层析

—

分离蛋白质⑵柱层析—分离蛋白质A.离子交换层析B.凝胶过滤层析

电荷大小A.离子交换层析B.凝胶过滤C.亲和层析D.疏水性层析

亲和疏水性

基质＋抗体基质＋疏水基团C.亲和层析D.疏⑶高压液相层析(HPLC）基质粒度小分辨率高分离速度快⑶高压液相层析(HPLC）基质粒度小4.电泳—

分析蛋白质、核酸

(1)原理氨基酸带有正、负电荷，因此蛋白质往往带有净正电荷或负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷的多少、大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为电泳。

4.电泳—分析蛋白质、核酸(1)原理大小电荷形状(2)SDS

—

根据蛋白质分子量、亚单位组成*

样品处理:SDS(十二烷基硫酸钠)2-巯基乙醇(2-ME)/二硫苏糖醇(DTT)*支持体:单体丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝胶*染色:考马斯亮蓝特异性蛋白(westernblotting)√大小电荷形状(2)SDS-PA细胞分离和细胞培养课件细胞分离和细胞培养课件

Western印迹技术将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测.

基本步骤:(1)SDS(2)转膜

(3)抗体反应一抗孵育标记二抗孵育

(4)显色Western印迹技术⑶等电聚焦电泳⑶等电聚焦电泳⑷.双向电泳—蛋白质分子量、等电点原理：等电聚焦:等电点

SDS:分子量⑷.双向电泳—蛋白质分子量、等电点原理：等电聚焦:等电点细胞分离和细胞培养课件5.质谱技术原理：通过测定样品离子的质/荷比来进行成分和结构分析的方法。应用：蛋白质鉴定（2002年诺贝尔化学奖获得者）5.质谱技术原理：通过测定样品离子的质/荷比（2002年诺贝四.细胞内分子的示踪技术

四.细胞内分子的示踪技术

1.同位素示踪技术——放射自显影术

(autoradiography)

将放射性前体物质掺入细胞，使放射性分子和细胞内原有的未标记分子混和，因它们的化学性质相同,细胞就会不加分辨地利用。1.同位素示踪技术——放射自显影术

●放射性化合物渗入活细胞●培养后取样、固定,进行光镜或电镜切片●在暗处把感光乳胶覆盖于切片上，存放在暗处●在此期间,放射性同位素衰变使乳胶曝光后显影及定影。根据银粒所在部位，就可知道细胞中放射性物质的分布。具体操作过程

●放射性化合物渗入活细胞具体操作过程A.细胞内生物大分子的定性、定位

与半定量

蛋白质——放射性同位素标记的

氨基酸

核酸——放射性同位素标记的

碱基A.细胞内生物大分子的定性、定位

与半定量蛋白质—举例：⑴分泌蛋白在细胞内定位①将胰岛β细胞与3H-亮氨酸共同孵育5分钟，②用未标记的亮氨酸冲洗。③在暗处把感光乳胶覆盖在切片上存放数日。④放射性同位素衰变使乳胶感光，经过显影和定影，根据感光乳胶黑色银颗粒所在位置即可知道细胞中放射物质的分布情况。举例：⑴分泌蛋白在细胞内定位①将胰岛β细胞与3H-亮氨酸共举例：⑵大肠杆菌DNA结构的证明举例：⑵大肠杆菌DNA结构的证明B.示踪细胞中几乎所有的过程对放射性分子在细胞内存在部位和化学形式进行追踪，就可测定放射性分子进入细胞后不同时间所在的位置和化学变化（光合作用）。B.示踪细胞中几乎所有的过程对放射性分子在细胞内存在部位和化举例：⑴分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌举例：⑴分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌举例：⑵DNA和RNA在细胞内合成过程用3H-胸苷、3H-尿苷渗入细胞

DNA在细胞核中合成RNA在细胞核中合成并保留在核内很快累积于细胞质中举例：⑵DNA和RNA在细胞内合成过程用3H-胸苷、3H-尿

2.抗体示踪技术A.抗体+荧光素LM(免疫荧光显微镜)

2.抗体示踪技术A.抗体+荧光素LM(免疫B.抗体+胶体金EM(免疫电镜)B.抗体+胶体金EM(免疫电镜)C.ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)

抗体＋酶酶酶底物显色C.ELISA(enzyme-linkedimmunos五、分子生物学技术五、分子生物学技术1.聚合酶链式反应—克隆DNA片断

(polymerasechainreaction，PCR)

（1）反应体系：模板链

DNA聚合酶

dNTP

引物（primer）（2）反应步骤：变性95℃

退火45℃～65℃

延伸72℃1.聚合酶链式反应—克隆DNA片断

(polymera2.核酸电泳2.核酸电泳3.核酸分子杂交—精确检测特定核苷酸序列

原理：碱基互补配对探针（probe