废水生物处理新发展

废水生物处理新发展第1页，课件共64页，创作于2023年2月

随着现代生物技术的发展以及向环境学科的不断渗透，一门新的学科－－环境生物技术应运而生。环境生物技术生物技术在环境学科中的应用，是现代生物技术与环境科学与工程紧密结合而形成的新兴交叉学科。2001-12-8第2页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8生物技术基因工程基因工程菌分子生物学技术微生物及微生物群落分析酶工程酶的应用发酵工程废水处理产能、产电等，CH4、H2、MFC、乙醇等第3页，课件共64页，创作于2023年2月酶在废水处理中的应用越来越受到重视，这是因为：（1）难降解有机污染物的排放日益增多，使用传统的化学和生物处理方法已很难达到令人满意的去除效果，这就需要寻找比现行方法更快捷、更经济、更可靠、更简便的方法；（2）人们已逐渐认识到酶能用来专门处理某些特定的污染物；（3）生物工程技术的发展使酶的生产成本降低。2001-12-8第4页，课件共64页，创作于2023年2月大多数废水处理过程可分为物理化学过程和生物处理过程。酶的处理介于二者之间，因为它所参与的化学反应建立在生物催化剂的作用基础上。将酶直接用于污染治理时，与传统的生物方法相比，存在以下一些潜在的优势：酶具有高度选择性，不易被有生物毒性的物质所抑制；可以处理生物难降解的化合物；可以处理各种浓度污染物，尤其是低浓度有机污染物；可以在各种pH、温度和盐度环境下使用；不存在冲击负荷效应；不存在与生物生长及其适应相关的滞后效应，所需HRT短；减少污泥产量（不产生污泥）；处理过程的控制简便易行。2001-12-8第5页，课件共64页，创作于2023年2月因此，酶处理方法是一种有前途的废水处理技术。特别适用于低浓度、高毒性污染物的处理。利用基因工程和蛋白质工程扩展酶的代谢途径，是治理难降解有毒有机污染物的主要方法。研究方向：酶的修饰、酶的固定化、酶反应器的开发等。2001-12-8第6页，课件共64页，创作于2023年2月

酶：过氧化物酶（如辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶）；聚酚氧化酶（如漆酶）；蛋白酶淀粉酶脂酶废水：含芳香族化合物的废水（如石化废水、印染废水）；含睛（氰）废水；食品加工废水。Return2001-12-8第7页，课件共64页，创作于2023年2月基因工程为改变细胞内的关键酶或酶系统提供了可能，从而可以：提高微生物的降解速率；拓宽底物的专一性范围；维持低浓度下的代谢活性；形成降解有毒污染物的新型催化活性；改善微生物的其他生物学特性。2001-12-8第8页，课件共64页，创作于2023年2月主要应用：开发脱氮除磷新工艺，增强脱氮除磷能力有毒有机污染物的降解重金属和放射性废水的处理2001-12-8第9页，课件共64页，创作于2023年2月难降解有机污染物、毒性有机污染物、持久性有机污染物（POPs）、内分泌干扰物等。共同特点：通常情况下（如活性污泥法），难以被生物降解。目前采用的方法：AOPs＋生物处理将来可能的方法：生物技术＋化工技术微生物基因改造；增加代谢途径微生物所处微环境的改造：固定化（人工包埋、生物膜），新型反应器的构建：改变微生物的微环境、抵抗污染物的毒性、提高在处理系统的持留能力等。2001-12-8

Return第10页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8废水处理目标传统方法去除污染物好氧（CO2）厌氧（CH4）将废水中的有机污染物转化成有价值的物质和能量载体：如甲烷、乙醇、氢气、电等。处理水回用回用资源化能源化第11页，课件共64页，创作于2023年2月废水中的能量回收：将废水有机污染物中或剩余污泥中储存的能量转化成甲烷、乙醇、氢气、电等形式的能量。产甲烷：较为成熟产乙醇：研究较少产氢气：提高氢的产率，产电：MFC（微生物学、电化学、材料学、工程学）。2001-12-8

Return第12页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8极端环境微生物嗜冷微生物寒冷地区的废水处理饮用水处理嗜盐微生物耐辐射微生物含盐废水处理放射性废水处理贫营养微生物第13页，课件共64页，创作于2023年2月基于现代生物学的分子方法，为深入研究废水生物处理过程中各种微生物的作用，为深刻理解废水处理过程的本质、提高处理系统的性能以及进行工艺革新等提供了新的强有力的方法和手段，为我们了解这些处理系统中的微生物生态并对处理过程进行工程控制提供了可能。分子生物学方法的出现使我们有可能更好的理解现有的生物处理工艺以及开发新的处理工艺。2001-12-8第14页，课件共64页，创作于2023年2月与建立在某些表型特性基础上的细胞富集培养方法不同，分子方法直接针对微生物群落的基因信息，分子技术测定的是细胞DNA或RNA的碱基序列。

分子方法以不同类型的DNA或RNA为目标，这取决于我们需要哪种信息。表1总结了检测目标以及每个目标能够提供的信息。2001-12-8分子方法探询的基因目标第15页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8目标获得的信息核糖体（r）RNA系统发育身份，它们是什么？DNA上编码rRNA的基因系统发育身份，它们是什么？DNA上的其他基因表型潜力，它们能够做什么？信使（m）RNA表型活性，它们正在做什么？蛋白质或其他报告产物表型活性或发育系统身份，它们是什么？或它们正在做什么？表1分子生物学方法探询的目标

第16页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8为了确定群落中的微生物在系统发育上的身份，以rRNA（通常是16SrRNA）或用于编码rRNA的基因为分子检测的目标。表型潜力，如对某种特殊基质的降解能力，可以通过在DNA上寻找相关基因来进行检测。已经得到表达的表型潜力可以通过检测mRNA或蛋白质产物（如酶）来证明。根据我们的研究需要，可以利用适当的分子方法来探询表1给出的基因目标，从这些基因分析中我们可以得到所需的信息。基因探询的目标如图1所示。图1总结了微生物细胞如何将DNA中的遗传密码转录和翻译成蛋白质分子的机制。第17页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8复制基因转录信使RNA蛋白质产物翻译氨基酸—转运RNA微生物细胞内的信息流动示意图DNA,mRNA,rRNA和蛋白质产物均可以作为分子方法探询的基因目标。

第18页，课件共64页，创作于2023年2月核糖体RNA（rRNA）是目前用于构建生物系统发育树比较可靠的基因目标，可以为我们提供微生物群落中某一特定微生物丰度方面的信息。目前人们最常用的基因目标是rRNA，这是基于以下原因。2001-12-8第19页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8（1）生物细胞需要rRNA将遗传信息翻译成蛋白质，因此，rRNA存在于所有的生物细胞中；（2）生物细胞内含有大量的核糖体，因此，rRNA相对来说容易检测到；（3）由于rRNA被包埋于核糖体中，因而相对较为稳定；（4）细菌和古细菌的小亚单位rRNA，即通常所说的16SrRNA，大约含1600个碱基对，这1600个碱基对可以提供足够的进化信息，从中选择15-20个碱基对序列的寡核苷酸片段用作探针，可以检测和鉴定多种微生物；（5）从环境样品中分离出rRNA并用于微生物系统发育、种类鉴定、多态性及多样性研究的方法已经全面建立。利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法总结如图2。

第20页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法

第21页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8分子信息及其应用

微生物细胞拥有一个复杂的信息流动网络，并用来决定其类型和控制其行为。这些信息在DNA中编码。DNA编码的基因并不实际承担任何细胞工作，如能量产生或合成。相反，它们通过精确的、多步骤机制解码DNA上的信息，并最终生成各种工作分子，如催化细胞内生化反应需要的酶。

第22页，课件共64页，创作于2023年2月目前常用的分子方法有:核酸分子杂交变性梯度凝胶电泳限制性片段长度多态性末端限制性片段长度多态性2001-12-8常用的分子生物学方法第23页，课件共64页，创作于2023年2月探针是能与特定核苷酸序列发生特异性结合的己知碱基序列的核酸片段。它可以是长探针（100-1000bp），也可以是短核苷酸片段（10-50bp）；可以是从RNA制备的cDNA探针，也可以是PCR产物或人工合成的寡核苷酸探针。探针既可用放射性核苷酸标记，也可用非放射性分子标记。核酸分子杂交的高度特异性以及检测方法的高度灵敏性，使核酸分子杂交技术广泛应用于检测环境中的微生物，并对它们的存在、分布、丰度和适应性等进行定性和定量分析。

2001-12-8第24页，课件共64页，创作于2023年2月核酸杂交的主要步骤是核酸分子的变性和选择性退火。双链DNA或处于二级结构的RNA分子通过变性回复到它们原来的单链、线性形式，从而使它们处于能与互补的核苷酸链退火杂交的状态。核酸杂交以碱基配对原理为基础，利用寡核苷酸探针与靶细胞专一性结合进行生物分析。核酸杂交的基本实验步骤为：细胞固定、杂交（专一性和严格性依赖于杂交温度和时间、盐浓度、探针长度及其浓度）、洗脱（去除与靶细胞没有结合和非专一性结合的物质）和检测，如下图所示。2001-12-8第25页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8标记探针的原理磷酸标记的探针变性、转膜3’5’5’3’加入标记探针、杂交3’5’3’5’放射自显影5’3’3’5’3’探针探针***5’3’***3’5’第26页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8核酸杂交的步骤

第27页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8核酸杂交试验并不要求探针与目标核酸序列之间百分之百地互补。有限数目的非互补碱基对的存在是可以接受的。互补的单链核苷酸分子经退火形成核酸双链分子的过程是可逆的。因此，可以通过改变反应的物理和化学环境（条件）从而增加核酸双链分子生成的速度、程度及其稳定性。影响两段互补核苷酸链杂交的因素包括：杂交和洗膜的温度、杂交时间、离子强度、甲酰胺浓度、碱基对之间非互补的程度以及探针分子和靶核酸序列的长度、复杂性和浓度等。

第28页，课件共64页，创作于2023年2月

核酸杂交技术研究环境微生物具有以下优点：（1）核酸可以直接从样品中提取，不必对微生物进行培养；（2）不管基因表达与否，都可以检测到特定的基因或核酸序列，从而能准确地跟踪、监测特定的微生物种群；（3）利用同一样品可以同时检测到众多不同的微生物类群；（4）可以直接检测到特定的核酸序列。

2001-12-8第29页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第30页，课件共64页，创作于2023年2月

核酸杂交技术应用于环境微生物研究的一个重要局限就是它要比传统的方法复杂得多。（1）从各种环境样品中提取核酸本身就包含众多繁冗的抽提和纯化操作，因此也是最复杂的步骤之一；（2）从富含能干扰核酸检测的污染物的样品（如土壤）中回收核酸，仍有待用一些特殊的技巧对现行的有关方法加以改善；（3）对任何一个自然微生物群落的研究常常需要对其多个平行样品进行分析和统计；（4）从水样等样品中检测以很低丰度存在的、或在整个微生物群落中仅占很小比例的微生物类群，核酸杂交技术的灵敏度尚需大幅度提高。2001-12-8第31页，课件共64页，创作于2023年2月核酸杂交技术的一个缺点是只有对已被分离并已测序的微生物才能够放心使用。微生物生态学家估计，到目前为止，在自然界中只有少数微生物能够被分离、培养。此外，被分离的微生物也可能并不能很好地代表自然环境中最重要的微生物。无论微生物是否已被分离或已完成测序，具有能提供微生物群落多样性指纹信息的分子技术是非常有用的。2001-12-8第32页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8变性梯度凝胶电泳法（DGGE）是一种使用日益广泛的方法。在DGGE方法中，DNA在含聚丙烯酰胺凝胶电泳池的一端。电泳池两端的电极形成一个电场，带负电的DNA向正极运动。DNA分子的移动速率取决于其分子大小与带电量之间的比值，因此，不同的DNA分子运动到两个电极之间的不同位置上停下，从而形成具有指纹作用的DNA带。将DNA带从凝胶中分离出来，可以进行进一步的扩增及测序。

变性梯度凝胶电泳法（DGGE）第33页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第34页，课件共64页，创作于2023年2月限制性片段长度多态性（RFLP）分析是另一种指纹分析方法。该法利用限制性内切核酸酶将被扩增的DNA切成片段，限制性酶对DNA的剪切能避开靶基因区。靶基因周围的侧翼区中具有不同数目的酶切位点。因此，限制性酶切后得到的DNA片段的大小不同，能够通过电泳分离。

2001-12-8限制性片段长度多态性（RFLP）第35页，课件共64页，创作于2023年2月报告基因法为评价已表达的表型潜力提供了另一条途径。在报告基因法中，利用重组技术将报告基因插入DNA分子上的目标区域。当DNA序列被转录时，报告基因也同时被转录。来自报告基因的mRNA被翻译成能催化某些易于检测的反应的酶。发光是最常见的报告基因效应，其中绿色荧光蛋白（GFP）最为常用。只有当完整序列被转录时才能观察到报告基因效应，因此，报告基因的表达意味着目标基因的表达。报告基因法可以对已表达的表型进行实时测定，其应用前景十分可观。2001-12-8报告基因法第36页，课件共64页，创作于2023年2月

绿色荧光蛋白作为新一代的基因转移报告物或定位标记物，在环境微生物研究中越来越受到关注，GFP的优点：（1）不需加任何底物，经激发后即可产生荧光，且荧光性质稳定；（2）相对分子质量小，对细胞无毒性；（3）检测方便，可对活细胞进行实时定位观察；（4）已有多种GFP突变蛋白，荧光特性得到明显改善。2001-12-8第37页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第38页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第39页，课件共64页，创作于2023年2月活性污泥中微生物多样性研究丝状细菌的研究脱氮微生物的研究除磷微生物的研究2001-12-8

分子方法的应用第40页，课件共64页，创作于2023年2月自1995年以来，基于16SrRNA基因库分析，人们对活性污泥和生物膜处理系统中微生物多样性进行了较广泛的研究。大量的16SrRNA基因序列研究表明，这些处理系统中最常出现的微生物主要有

-、

-和

-Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。这些发现与利用荧光原位杂交（FISH）研究活性污泥系统得出的结果一致。利用16SrRNA数据库还可以预测在所分析的系统中存在的细菌种属。2001-12-8活性污泥中微生物多样性的研究

第41页，课件共64页，创作于2023年2月一些复杂系统中实际的微生物种群组成不能够仅仅根据16SrRNA基因库来推测，而必须根据定量FISH分析结果来确定。定量FISH方法还很少用于研究实际废水处理厂中微生物的种群结构，这可能是由于对不同探针标记的微生物在显微镜下进行计数非常费事，且技术上也有一些困难。半自动数字图像分析方法极大地加快了定量FISH的分析速度，并且使微生物学家第一次得到了活性污泥中微生物种群组成的高清晰度的、完整的图像。2001-12-8第42页，课件共64页，创作于2023年2月在活性污泥中存在一定数量的丝状菌对于污泥絮体的形成是重要的，但是，出现大量的丝状菌对于废水处理则是有害的，因为它们会导致在污泥中形成泡沫、或者使二沉池中活性污泥的沉降性变差（引起污泥膨胀）。许多丝状细菌难于培养，因此，人们对于丝状菌了解不多，目前仅有一些在显微镜下可以观察到的特征。据报道，人们在处理生活污水的处理厂观察到了30多种不同形态特征的丝状菌，在处理工业废水的活性污泥厂又观察到了约40多种其他形态特征的丝状菌。

2001-12-8第43页，课件共64页，创作于2023年2月利用透射电子显微镜（TEM）和定量FISH技术可以研究活性污泥中的丝状菌。利用显微操作技术富集和分离丝状微生物，然后进行16SrRNA基因序列分析。研究结果清楚地表明，一些分类学上相距较远的细菌，通常具有在光学显微镜下难于分辨的相同形态特征。因此，对丝状菌根据其形态特征进行分类提出了强烈的置疑。在活性污泥中，有些丝状菌可以呈现出非丝状菌的生长形式。因此，仅仅根据形态特征进行鉴定有时是不可靠的。2001-12-8第44页，课件共64页，创作于2023年2月基于丝状菌的16SrRNA基因序列，人们开发出了一套用于直接鉴定活性污泥中丝状菌的定向于rRNA的寡核苷酸探针。利用寡核苷酸探针和抗体染色技术，可以定量地研究活性污泥中丝状菌与污泥形成泡沫的关系。

2001-12-8第45页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第46页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第47页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第48页，课件共64页，创作于2023年2月氨氮是生活污水中主要的含氮化合物（尿素极易水解形成氨），在污水处理厂中通过微生物的硝化和反硝化作用去除。尽管在教科书中仍然认为，Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterspp.是主要的氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌，但是，实际情况要复杂得多。

2001-12-8脱氮微生物的研究

第49页，课件共64页，创作于2023年2月NH4+氧化为NO2-的过程需要经过2个步骤：

2H++NH4++2e-+O2NH2OH+H2O+2H+NH2OH+H2OHONO+4e-+4H+上述2个反应分别由氨单氧合酶（ammoniamonooxygenase，AMO）和羟胺氧化还原酶（hydroxylamineoxidoreductase，HAO）催化，其中AMO催化NH3氧化为NH2OH的反应，HAO催化NH2OH氧化为NO2-的反应（见图）。在细胞内（invivo）和细胞外（invitro）进行的一系列研究，使我们获得了关于AMO和HAO的结构与活性方面的大量信息。2001-12-8第50页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8氨氧化途径及其相关基因

第51页，课件共64页，创作于2023年2月AMO除可以氧化NH3以外，还可以氧化一系列的底物，将C-H键氧化成醇，将C=C键氧化成环氧化合物。反应底物包括烷烃、芳烃、卤代烃等。这为生物修复受氯代烃污染的环境提供了一种新的途径。2001-12-8第52页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8Nitrosomonas细胞内由AMO催化的几种反应

第53页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8MAR-FISH技术分析活性污泥中被标记为红色的Nitrospira-类亚硝酸氧化菌的照片第54页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8第55页，课件共64页，创作于2023年2月许多水域发生的水体富营养化使人们对硝化过程的研究越来越深入，氨氧化反应是硝化过程的关键步骤。现代分子生物学技术为氨氧化细菌的研究提供了有力的工具，人们对氨氧化微生物的生物化学和分子生物学特性有了较为深入的研究，弄清了氨氧化过程涉及的关键酶及其基因，并且可以对某些氨氧化细菌进行基因操作，为控制废水生物脱氮工艺以及富营养化水体的生物修复提供了新信息。

2001-12-8第56页，课件共64页，创作于2023年2月生物强化除磷（enhancedbiologicalphosphorousremoval，EBPR）工艺在废水处理厂得到了广泛应用，但工艺运行过程中经常出现故障。分子生物学研究表明，以前人们认为的传统的除磷微生物，Acinetobacter，在EBPR工艺中并不起除磷作用。然而，直到最近，人们才在实验室规模的反应器中鉴定出聚磷菌（phosphate-accumulatingorganisms，PAOs）是与Rhodocyclus有关的

-Proteobacteria。2001-12-8第57页，课件共64页，创作于2023年2月基于克隆基因库，根据与Rhodocyclus有关的16SrDNA序列，设计出了专一性的分子探针，用于除磷微生物的研究。通过比较探针标记的细胞数目和含聚磷酸盐的细胞数目，可以发现，在EBPR除磷工艺中，Microlunatusphosphovorus占整个含聚磷酸盐的细胞数目的1/3。基于从除磷活性污泥样品的16SrDNA克隆基因库构建专一性探针，结合细胞内聚磷酸盐颗粒的特殊染色技术，人们可以利用显微镜对除磷微生物进行原位观察和鉴定。2001-12-8第58页，课件共64页，创作于2023年2月2001-12-8FISH技术分析活性污泥中被标记为黄色的类Rhodocyclus的聚磷菌白圈表