吸附柱层析法是分离课件

菠菜色素的提取与分离

菠菜色素的提取与分离1实验目的1.了解天然物质分离提纯方法；2.掌握柱层析操作技术；3.了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。

实验目的1.了解天然物质分离提纯方法；2实验原理柱色谱法又简称柱上层析法。简称柱层析。分为吸附色谱、分配色谱和离子交换色谱。本实验仅介绍吸附柱层析法。吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。吸附色谱常用氧化铝或者硅胶作为吸附剂，填装在柱中的吸附剂把混合物中各组分先从溶液中吸附到其表面上，而后用溶剂洗脱。溶剂流经吸附剂时发生无数次吸附和脱附的过程，由于各组分被吸附的程度不同，吸附强的组分移动的慢留在柱的上端，吸附弱的组分移动的快在下端，从而达到分离的目的。实验原理柱色谱法又简称柱上层析法。简称柱层析。分为吸附色谱、3实验原理(1)吸附剂的选择：理想的吸附剂应具有如下条件：能够可逆地吸附待分离的物质；不能使被吸附物质发生化学变化；粒度大小应使展开剂以均匀的流速通过色谱柱。(2)溶剂和洗脱剂的选择溶解样品的液体叫溶剂，用来洗色谱柱的液体叫洗脱剂或淋洗液。二者常用同一物质。洗脱剂的极性对混合物的分离影响较大。极性越大，洗脱能力越强，化合物移动越远。实验原理(1)吸附剂的选择：4实验原理(3)色谱柱的填装色谱柱一般用透明的玻璃做成，先将色谱柱固定于支架上，一定要竖直，柱的下端铺一层脱脂棉（或玻璃棉）。为保持平整的表面，可在脱脂棉上再铺一层5mm厚的石英砂。如果色谱柱下端是砂芯的可直接使用。色谱柱可分为干法装柱和湿法装柱。实验原理(3)色谱柱的填装5菠菜叶中的叶绿体含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类天然色素。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。几种色素之间因吸附剂对其吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。本实验是用活性氧化铝作吸附剂，分离菠菜中胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。

菠菜叶中的叶绿体含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）几6实验装置实验装置71.菠菜色素的提取称取10g新鲜菠菜汁（菠菜已由老师预先用搅拌机绞碎）与10mL甲醇拌匀，在小烧杯中研磨5分钟，用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。保留残渣残渣放回烧杯中，每次用10mL石油醚-甲醇（体积比3:2）混合液进行提取，每次需加以研磨且抽滤，共提取两次。每次保留提取液。合并提取液用10mL水洗后除去甲醇，洗涤2次。洗涤时轻轻旋荡，以防止乳化，弃去水-甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥5min。干燥后蒸馏浓缩至体积约为1mL为止。

实验步骤1.菠菜色素的提取实验步骤82.薄层层析

将上述的浓缩液点在硅胶板上，分别用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）两种溶剂展开，经过显色后，进行观察并计算比移值。2.薄层层析93.柱层析装柱：在层析柱中，加入15cm高的石油醚，另取少量脱脂棉，先在小烧杯内用石油醚浸湿，挤压去除气泡，然后放在层析柱底部，在它上面加一片直径比柱略小的圆形滤纸。将15g中性氧化铝，从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用装在玻璃棒上的橡胶塞轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得平稳致密。柱中溶剂面，由下端旋转控制，不使满溢，更不能让干。

装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面剩下1-2mm高为止。

3.柱层析10层析：将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部。加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以下1mm左右，关闭活塞，用滴管滴加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加入约1.5cm高度的洗脱剂----石油醚-丙酮（9:1）、然后在层析柱上面装一滴液漏斗，内装15mL洗脱剂，打开上下两个活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集，当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙色溶液，即胡萝卜素，约用洗脱剂50mL。层析：11如时间和条件允许，可用体积比7：3的石油醚-丙酮做洗脱剂，分出第二个黄色带，即叶黄素；再用体积比3:1:1的丁醇-乙醇-水洗脱叶绿素a和叶绿素b。

如时间和条件允许，可用体积比7：3的12注意事项1.萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。2.为了保持柱子的均一性，吸附剂应浸泡在溶剂中，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。3.在吸附剂上端加入滤纸是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉可以防止吸附剂细粒流出。4.层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。5.洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，