蛋白质组双向电泳原理及实验步骤课件

中南大学湘雅医学院精神卫生1201班吴所谓方圆

蛋白质组双向电泳中南大学湘雅医学院蛋白质组双向电泳1蛋白质组（Proteome）：

在一种细胞内存在的全部蛋白质。蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双向电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等。蛋白质组（Proteome）：2原理Theory

实验操作Method

应用Application

原理实验操作应用Application3+–pH3pH7.5pH10第一向：等电聚焦

+–pH3pH7.5pH10第一向：等电聚焦

4–chargesize第

二

向：SDS

电

泳

+pH3pH7.5pH10–chargesize第

二

向：SDS

电

泳

5样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS电泳（SDSelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）双向电泳实验流程

样品制备（Samplepreparation）双向电泳实验6样品制备基本原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。样品制备基本原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制7可溶性样品

固体组织样品

细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。可溶性样品固体组织样品细胞不同样品的基本处理方法样品的分8双向电泳样品的溶解是成功进行双向电泳的最关键因素之一溶解的目标：样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；保证样品在电泳过程中保持溶解状态。溶解的手段：

离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质

双向电泳样品的溶解是成功进行双向电泳的最关键因素之一9MoreDatawithNarrowRangeIEFpH3-10pH3-6pH5-8pH7-10

BroadRangeSeparationsMoreDatawithNarrowRangeIE10聚焦时间的优化要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。聚焦时间的优化要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的11两维间的平衡等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS电泳能顺利进行。两维间的平衡等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－12二维SDS同普通SDS类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。

二维SDS同普通SDS类似。13操作Method

操作14样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS电泳（SDSelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）

双向电泳实验流程

样品制备（Samplepreparation）双向电泳实验15最高电压10,000V10–25C温度控制7,11,17,18,和24cm的聚焦盘，可以各放12根胶条可以储存10个程序，每个程序有10步程序可进行时时编辑可供选配的打印机最高电压10,000V16等电聚焦的操作等电聚焦的操作17蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件18蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件19蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件20蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件21等

电

聚

焦

程

序

的

设

置7cm胶条水化 12小时（17℃） 被动水化S1 250V 慢速 30分钟 除盐S2 1000V 快速 60分钟 除盐S3 4000V 线性 3小时 升压S4 4000V 快速 24,000伏小时 聚焦

~28,000伏小时S5 500V 快速 任意时间 保持l

选择所放置的胶条数。l

设置每根胶条的极限电流。（30-50

A/根）l

设置等电聚焦时的温度。（17℃）等

电

聚

焦

程

序

的

设

置7cm胶条22配制SDS凝胶配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。聚合30分钟。待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。配制SDS凝胶配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向23胶条的平衡冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。配制胶条平衡缓冲液I。吸去胶条上的矿物油及多余的样品。第一次平衡。振荡15分钟。配制胶条平衡缓冲液II。第二次平衡，振荡15分钟。吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。胶条的平衡冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。24胶条的转移胶条的转移25蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件26蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件27蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件28蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件29SDS电泳在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。SDS电泳在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转30考马斯亮兰染色Bio-Safe染色凝胶染色

考马斯亮兰染色凝胶染色31水洗3次，5min/次。Bio-Safe染色1小时。水洗30min.Bio-Safe染色法

水洗3次，5min/次。Bio-Safe染色法32图像扫描及软件分析图像扫描及软件分析33

Molecularmass(kD)

Isoelectricpoint

1100

201

120

100

56

38

30

20

7

Fig1上下图分别为正常大鼠和失神经大鼠腓肠肌蛋白双向电泳图谱，右图为左图方框内的局部放大图。

Molecularmass(kD)Isoelectr34应用Application

应用35

双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中挥着重要作用，可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，