保元汤对莲花隐杆线虫的抗衰老作用及机制研究

保元汤对莲花隐杆线虫的抗衰老作用及机制研究

宝元汤最初出现在明代的《爱心经》中。这是治疗情绪虚弱的著名方剂。这组药物包括黄原、人参、甘草和肉桂。它们可以补充很多空气，补充后天的脾脏和肺气，健康的脾脏，保护肺部，温肾，治疗气弱性疾病。因此，包元汤被称为保元汤，并通过历代医家的临床应用来验证其准确性。1材料和方法1.1长培养基培养菌株野生型N2秀丽隐杆线虫，采用线虫生长培养基(NGM)，以大肠杆菌EscherichiacoliOP50饲喂，由美国宾夕法尼亚大学提供。1.2药物和试剂1.2.1实验药物保元汤药物组成:黄芪、人参、甘草、肉桂，比例6∶2∶2∶1(北京同仁堂南京药店有限公司)。1.2.2测试试剂NGM培养基配方:氯化钠(NaCl)3g，蛋白胨2.5g，琼脂17g，磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(K1.3高压灭菌锅及生化培养箱超净工作台(苏净安泰空气技术有限公司);显微镜(日本Olympus公司);高压灭菌锅[致微(厦门)仪器有限公司];生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);离心机、旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)。1.4实验方法1.4.1保元汤粗提物的制备依据保元汤方药物比例称取药材30g，研成粉末，加10倍量水采用回流提取法提取1h，提取3次，合并3次药液，旋转蒸发仪蒸发至100mL，最后采用真空冷冻干燥法获得保元汤粗提物。1.4.2秀丽隐杆线虫接种于空白的NGM培养基中央滴入50μL左右的大肠杆菌菌液，用涂布器将菌液均匀涂布，注意菌液边缘不宜太过，应距离平板边缘5mm左右，采用团块法将秀丽隐杆线虫接种在含大肠杆菌的NGM培养基上，20°C培养箱中恒温培养1.4.3秀丽隐杆线虫线虫裂解观察用液体NGM冲下培养基中的L4期秀丽隐杆线虫成虫，转至10mL无菌离心管中，高心机1300×g离心1min，洗涤2次，保留与约0.25mLNGM，加无菌水3.75mL，加碱裂解液[氢氧化钠(NaOH)(5mol/L)0.5mL，漂白剂(Bleach)1mL]至混匀振荡，每2min至于显微镜下观察秀丽隐杆线虫线虫裂解状态，裂解时间不超过6min。1300×g离心1min，液体NGM洗涤2次，S-培养基洗涤2次，移除上清，加S-培养基8mL，置于20℃培养箱中振摇孵育24h，从而得到生长同期化的秀丽隐杆线虫1.5观察指标和方法1.5.1观察时间及监测结果比较各组秀丽隐杆线虫的寿命变化情况，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预，每组100条左右，给药当日年龄标记为0。每日显微镜观察秀丽隐杆线虫的状态，记录存活、死亡数量，计算平均寿命。观测前将96孔板置于摇床上轻轻振摇2min，秀丽隐杆线虫死亡判定标准为振动或强光刺激秀丽隐杆线虫不弯曲身体或头部不摆动，身体呈僵直状态。1.5.2各组不同给药时间比较各组秀丽隐杆线虫的生殖力变化情况，采用同期化的L1期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L1期后，各组进行给药干预。药物干预48h后，用移液器吸取秀丽隐杆线虫，转至标注好的1.5mL离心管中，1300×g离心1min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板1条，每组15条，转移至20℃培养箱中培养24h，显微镜下观察统计每块培养皿上的虫卵数目。1.5.3预给药、给药及药物干预的运动能力变化情况，正常情况下其以S形向前移动，衰老后运动能力下降，运动弯曲的频率减少，可反映其生命活力，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物干预6d后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5mL离心管中，1300×g离心1min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，每组15条，让其自由运动1min，显微镜下统计秀丽隐杆线虫1min内运动S形的个数(即1min内走过的峰数)，重复3次。1.5.4移液加线虫观察比较各组秀丽隐杆线虫的头部摆动变化情况，头部摆动行为定义为头部摆动方向改变且改变角度大于90°，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物干预6d后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5mL离心管中，1300×g离心1min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，每组15条，让其自由运动1min后，观察记录其在1min内头部摆动次数。1.5.5给药干预干预比较各组秀丽隐杆线虫的热应激能力变化情况，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物处理2d后，每组15条，去除封口膜，将96孔板上秀丽隐杆线虫一起转移到35℃培养箱中热应激10h，然后再将其转移到20℃培养箱中继续培养，每日显微镜下观察记录秀丽隐杆线虫死亡、存活条数，直至空白对照组秀丽隐杆线虫存活率<10%。存活率(%)=(总数-死亡数目)/总数×100%。1.5.6不同机溶剂给药干预比较各组秀丽隐杆线虫的氧化应激能力变化情况，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。。药物处理2d后，每组15条，各组分别加入20mmol/L百草枯，进行氧化应激处理，培养24d后，开始每日显微镜下观察统计秀丽隐杆线虫死亡、存活条数，直至空白对照组秀丽隐杆线虫存活率<10%。1.6统计方法采用GraphPadPrism5.02软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差2结果2.1各组秀丽隐杆线虫寿命情况比较由表1可见，溶剂对照组秀丽隐杆线虫平均寿命与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。保元汤各组中100、200、500μg/mL组秀丽隐杆线虫平均寿命较空白对照组均明显延长，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);50、1000μg/mL组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.2各组大鼠产卵量、保元汤时间比较由表2可见，溶剂对照组及保元汤各组秀丽隐杆线虫平均产卵量与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，保元汤各组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.3各组秀丽隐杆线虫运动能力情况比较由表3可见，溶剂对照组秀丽隐杆线虫1min平均运动峰数与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。保元汤各组中200、500、1000μg/mL组秀丽隐杆线虫1min平均运动峰数较空白对照组均明显增多，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);50、100μg/mL组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.4各组秀丽隐杆线虫摆动情况比较由表4可见，溶剂对照组秀丽隐杆线虫1min平均摆动次数与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。保元汤各组中200、500、1000μg/mL组秀丽隐杆线虫1min平均摆动次数较空白对照组均明显增多，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);50、100μg/mL组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.5线虫热性能比较热应激测试后的第1、2天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫均出现明显死亡，而保元汤各组可以显著提高秀丽隐杆线虫的耐热能力，其中200、500、1000μg/mL组存活率均明显高于空白对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。热应激测试第3天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫几乎全部死亡，而保元汤各组还有约10%以上存活率，其中200、500、1000μg/mL组存活率明显高于空白对照组(P<0.05)。见图1。2.6各组秀丽隐杆线虫抗氧化应激损伤的能力氧化应激测试第1、2、3天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫均出现明显死亡，而保元汤各组可以显著提高秀丽隐杆线虫的抗氧化应激损伤的能力，其中200、500、1000μg/mL组存活率均明显高于空白对照组。氧化应激测试第4天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫几乎全部死亡，而保元汤各组还有约10%以上的存活率，其中200、500、1000μg/mL组存活率明显高于空白对照组(P<0.05)。见图2。3保元汤在不同给药剂量对秀丽隐杆线虫寿命的影响中医学对衰老的认识和研究源远流长，早在《内经》中就有“”正气存内，邪不可干”的论述，认为气是构成人体和维持人体生命活动的基本物质，机体正气充足，则抵御外邪能力强，从而身强体健不易发病而可得“天年”，气虚、气不足可导致机体的脏腑功能减退，加速衰老衰老是指生物体在正常状况下发育成熟后，随着年龄的继续增加，机体的生理功能出现逐渐下降的表现，最终导致生命体死亡的过程，因此在延缓衰老的研究中寿命的长短可作为其一个定量指标在衰老领域，长寿和生殖总是被联系在一起，且普遍认为寿命与其生殖能力成反比关系，对大多数生物体而言，当生殖期结束则机体就逐渐开始呈现衰老。有研究认为，包括线虫、黑腹果蝇、人类等有机体都有通过干预生殖功能来实现延长寿命的可能性，但目前这个观点还有颇多争议运动能力可反映秀丽隐杆线虫的生命活力，秀丽隐杆线虫在运动过程中以正弦曲线S的形式向前移动，当秀丽隐杆线虫出现衰老时其运动能力也会明显下降，因此我们通过观察秀丽隐杆线虫运动来辅助证明药物延缓衰老的作用。同时秀丽隐杆线虫头部摆动能力在一定程度上反映秀丽隐杆线虫的衰老，其头部摆动与身体肌壁组织、摄食行为有一定的关系，摆动次数越多说明，说明其生命活力越强。本实验结果显示，保元汤在200、500、