第1-4章 临床免疫学和免疫学检验总论

临床免疫学与免疫学检验

胡波

中山大学第三附属医院1第一章概论免疫学(Immunology)是研究免疫系统的结构与功能，并通过对其在免疫应答过程中所产生的免疫保护与免疫损伤机制的研究，探讨有效的免疫措施，实现以防病、治病为目的的一门现代医学学科。2①免疫学经验时期（11~17世纪）：中国医生发明了用人痘苗预防天花将天花痂粉吹入正常人鼻孔来预防天花不十分可靠仍然有感染的危险免疫学的形成与发展3②经典免疫学时期（18世纪末到20世纪中叶）——抗感染免疫英国医生创造出牛痘苗接种法为人类战胜了天花做出了贡献1880年，法国微生物学家L.Pasteur偶然发现接种陈旧的鸡霍乱杆菌培养物可使鸡免受毒性株的感染，成功地创制了炭疽杆菌减毒疫苗和狂犬病疫苗，并开始了免疫机制的研究。1883年，俄国动物学家发现了白细胞的吞噬作用并提出了细胞免疫学说。1890年，德国医师和日本学者北里发现了白喉抗毒素。1894年比利时血清学家J.Bordet发现了补体。41896年H.Durham等人发现了凝集反应，1897年R.Kraus发现了沉淀反应，1900年K.Landsteiner发现了人类ABO血型，J.Bordet发现了补体结合反应。1901年，“免疫学”一词首先出现在《IndexMedicus》中，1916年《JournalofImmunology》创刊。此后的几十年中，血清学研究代表了免疫学发展的主流。

5③近代免疫学时期（20世纪中叶）：1945年R.Owen发现同卵双生的两只小牛的不同血型可以互相耐受。1948年C.Snell发现了组织相容性抗原。1953年R.Billingham等人成功地进行了人工耐受试验。1956年Witebsky等人建立了自身免疫病动物模型。这些免疫生物学现象迫使人们必须跳出抗感染的圈子，甚至站在医学领域之外去看待免疫学。

6克隆选择学说（cloneselectiontheory）于1958年由澳大利亚学者F.Burnet提出。该学说认为：体内存在识别各种抗原的免疫细胞克隆；抗原通过细胞受体选择相应的克隆并使之活化和增殖，变成抗体产生细胞和免疫记忆细胞；胚胎时期与抗原接触的免疫细胞可被破坏或抑制，称为禁忌细胞株（forbiddenclone）；部分免疫细胞可因突变而与自身抗原起反应。这个理论虽不十分完善，但解释了大部分免疫现象，为多数学者所接受并被后来的实验所证明，可以说是一个划时代的免疫学理论。

7④现代免疫学时期——器官、细胞和分子水平1956年B.Glick发现了腔上囊的作用1961年J.Miller发现了胸腺的功能1966年H.Claman等人区分出B细胞与T细胞，并且发现了它们的免疫协同作用，以后又相继发现了T细胞中不同的亚群及其鉴定方法。1950年R.Porter用蛋白酶水解获得了抗体的片段。G.Edelman用化学断裂法得到了抗体的多肽链，共同证明了抗体的分子结构；1957年G.Kǒhler和C.Milstein等人用B细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体；1978年S.Tonegawa发现了免疫球蛋白的基因重排。

80年代以来，众多的细胞因子相继被发现8基本概念免疫：机体识别“自身”与“非己”抗原，对自身抗原形成天然免疫耐受，对“非己”抗原产生排异作用的一种生理功能。免疫功能：免疫系统在识别和清除“非己”抗原过程中所产生的各种生物学作用的总称，主要包括三方面的内容：免疫防御，免疫自稳，免疫监视。9免疫防御（immunologicaldefence）

——指机体排斥外源性异物的能力。免疫自稳（immunologicalhomeostasis）

——指机体识别和清除自身衰变残损的组织细胞的能力，以维持正常内环境稳定。免疫监视（immunologicalsurveillance）

——指机体杀伤和清除异常突变细胞的能力，以监视和抑制恶性肿瘤在体内生长。免疫系统的三大生理功能10

免疫应答反应（immuneresponse）

是指机体免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程。免疫应答的过程主要分为： 识别阶段（recognitionphase） 活化阶段（activationphase） 效应阶段（responsephase）抗原识别处理传递信息免疫细胞活化增殖产生效应细胞、分子执行效应功能11

免疫应答效应大多为生理性，是机体对外来抗原或自身变性抗原的清除效应。

免疫应答反应过强时，可致机体组织或器官发生病理损伤，出现临床疾病。如：自身免疫性疾病、超敏反应性疾病等12功能名称生理功能病理表现免疫防御清除病原微生物及其它抗原性异物超敏反应（强）免疫缺陷病（弱）免疫自稳清除损伤或衰老细胞自身免疫性疾病免疫监视清除突变或畸变细胞，防止肿瘤发生、杀伤病毒感染细胞肿瘤或病毒持续性感染免疫系统功能的生理和病理表现13二、免疫组织与器官免疫系统(immunesystem)由免疫器官、免疫细胞和免疫分子构成。免疫器官按功能不同，分为中枢免疫器官和外周免疫器官。

14通过免疫网络，免疫细胞能及时到达机体各脏器及皮肤粘膜的病原微生物入侵部位，又能将机体各部位的抗原成分经抗原递呈细胞携带至相应淋巴组织及淋巴器官，活化T淋巴细胞与B淋巴细胞，执行特异性免疫应答功能。单核细胞和淋巴细胞经血液循环及淋巴循环，进出于外周淋巴组织及淋巴器官，形成机体免疫系统的免疫网络。15（一）中枢免疫器官：免疫细胞产生、分化和成熟的场所。骨髓:（1）是造血干细胞生成、分化发育的场所；

（2）是功能性B细胞分化成熟的唯一场所；（3）提供各种免疫细胞的前体细胞；

T细胞分化成熟的场所胸腺:T细胞分化成熟的场所（二）外周免疫器官：免疫应答的场所。淋巴细胞定居和发挥功能的场所.淋巴结、脾脏、粘膜相关淋巴组织16淋巴结的功能主要有以下3个方面：①生成淋巴细胞：淋巴细胞可以在淋巴结内进一步分化、转化和增殖。②过滤淋巴液：由淋巴结内巨噬细胞的吞噬来完成，淋巴液中衰老的细胞及颗粒物质都可被吞噬。例如：人体吸入的尘埃颗粒，通过呼吸道进入支气管淋巴结，被巨噬细胞吞噬，以致此淋巴结成为黑色。③免疫作用：通过淋巴结内的各种细胞本身具有的杀伤作用及其产生的抗体(即免疫球蛋白)来防御、杀灭和消除体内的病原菌、肿瘤细胞等。17(三）淋巴细胞再循环与归巢淋巴细胞通过淋巴循环和血液循环往返于全身器官组织，通过循环可增加与抗原接触的机会，并将被抗原激活的淋巴细胞引流入局部淋巴组织及器官，完成防御、自稳、监视等免疫功能。18外周免疫器官及外周淋巴组织既是淋巴细胞再循环的起点和中途站，也是淋巴细胞归巢的终点。淋巴细胞在发挥免疫效应的同时，被归巢受体引导回该类细胞的原定居处，进行修整、增殖和发育，以提高该类淋巴细胞的数量和功能，这是保证淋巴细胞功能健全的重要环节。19三、免疫细胞凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞统称为免疫细胞，按免疫细胞在体内的作用不同分为三大类。20

T细胞（Thymus-dependentcell） 淋巴细胞B细胞（Bonemarrowdependentcell） NK细胞（NaturalKillercell）

能增殖分化并产生免疫效应淋巴细胞分类21

单核细胞 巨噬细胞免疫辅助细胞参与辅助淋巴细胞的活化

中性粒细胞嗜酸性粒细胞免疫应答细胞嗜碱性粒细胞肥大细胞

参与免疫应答中的某一环节22T细胞B细胞NK细胞主要功能抗原识别抗原识别细胞毒性细胞免疫体液免疫免疫监视免疫调节免疫调节分布外周血液70%～75%10%～15%＜10%淋巴结70%～75%20%～25%很少脾脏30%～50%50%～65%≤5%表1-1不同淋巴细胞及功能简介23四、免疫分子

免疫分子是由一些免疫活性细胞或相关细胞分泌的蛋白质及小分子多肽物质组成，它们参与机体的免疫反应或免疫调节。24

免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）补体系统（Complement,C）细胞因子（Cytokine）细胞粘附分子（CellAdhesionMolecules,CAM）白细胞分化抗原（ClusterDifferentiationantigen,CD）主要的免疫分子25

抗体和免疫球蛋白抗体（antibody，Ab）：由抗原刺激B细胞活化、增殖、分化成浆细胞而产生的能与相应抗原特异性结合的糖蛋白，主要存在于血清等体液中，是介导体液免疫的重要效应分子。免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白的统称。26

抗体与免疫球蛋白的关系1.所有的抗体都是免疫球蛋白；2.免疫球蛋白并非都是抗体。免疫球蛋白是化学结构上的概念；抗体是生物学功能上的概念。27免疫球蛋白的基本结构

四肽链分子，即由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的免疫球蛋白单体，呈“Y”形。

28重链和轻链重链（heavychain，H链）：根据H链恒定区抗原性的差异可将其分为μ、γ、α、δ、ε五类；与L链组成完整的Ig分子，分别称为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。轻链（lightchain，L链）：分为κ和λ两型。2930免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶水解片段胃蛋白酶水解片段3132F(ab’)2片段的意义：

既保留了结合双价抗原的生物学活性，又避免了Fc段作为抗原的免疫原性和免疫结合性。用于治疗时，可以避免或减轻可能引起的毒副作用；用于免疫检测时，可以避免标本中抗抗体对检测结果的干扰。

33第二节临床免疫学34临床免疫学(clinicalimmunology)是将免疫学基础理论、临床医学疾病与免疫学技术相结合，用于研究疾病的免疫病理机制、诊断与鉴别诊断、评价治疗效果和判断愈后的多个分支学科的总称。

35临床免疫学发展的主要方向：是将基础免疫学研究所取得的理论成果应用于临床疾病的诊治，探讨新的免疫现象与临床疾病的关系。36免疫病理学(immunopathology)：通过研究免疫细胞、炎性细胞、免疫分子，了解当这些细胞或分子的功能失衡或缺陷与导致自身免疫性疾病、免疫缺陷病、免疫增殖病之间的相互关系。探讨免疫相关性疾病患者疾病发生发展过程中的免疫病理改变，对治疗与预后评价有着重要的临床意义。一、免疫病理与免疫性疾病37移植免疫学(transplantationimmunology)：通过组织、细胞或器官移植，以替代机体丧失功能的组织器官或细胞，移植后保证移植物存活，不发生排斥反应的一门科学。二、移植免疫38肿瘤免疫学(tumorimmunology)是研究肿瘤相关抗原和肿瘤的免疫诊断、肿瘤的发生发展与机体的免疫状况、机体对肿瘤的免疫应答和抗肿瘤免疫效应机制的一门分支学科。

三、肿瘤免疫39感染免疫学（infectionimmunology）是研究病原生物与宿主相互关系的学科，是传统免疫学的基础与核心。当前感染免疫研究的重点：掌握免疫系统在杀伤被病原体感染的宿主细胞时对宿主的损伤程度。免疫应答过程中激活或抑制的效应细胞当病原体被清除后所发挥的作用。固有性免疫与获得性免疫间的相互调节关系。生物疫苗在免疫防御中的特点。四、感染免疫40第三节临床免疫学与免疫检验41一、免疫学技术的发展免疫学检验（laboratoryimmunology）是研究免疫学技术及其在医学检验领域的重要学科。42发展进程的主要阶段自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合43免疫检验可分为两部分：一部分为利用免疫检测原理与技术检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质；另一部分是利用免疫检测原理与技术检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。二、临床免疫学与免疫检验44

放射免疫技术 化学发光免疫技术 荧光免疫技术 流式细胞免疫技术 酶联免疫技术 免疫印迹技术 速率散射免疫技术 单克隆抗体技术免疫检验涉及的主要技术45确定诊断分析病情调整治疗方案判断预后提供有效实验依据临床应用46丙型肝炎的免疫检验1974年，纽约血液中心的工作人员发现除乙肝外，还有另一种因子能引起输血后肝炎，当时称为非甲非乙型(nonA,nonB)肝炎。但显微镜下看不到病毒，分离培养不成功。常规制作EIA和RIA试剂，检测均无结果。感染动物成功。能做理化性质测定（分子量、沉降系数、对酸碱环境的耐受能力等）。47用分子克隆的方法来甄别和鉴定病毒，建立特异性的免疫及基因检测方法。

用含病毒的血液感染黑猩猩，并对其进行免疫抑制，使感染加重，病毒滴度提高；从高滴度的病毒浓缩物中提取总RNA，采用随机引物逆转录合成cDNA，插入载体中表达；用表达的蛋白作为抗原，与患者血清反应，对构建的cDNA文库进行免疫学筛选，1989年得到第一个特异性的阳性克隆；逆转录PCR，扩增并克隆cDNA，完成了HCV全基因组序列克隆和序列测定；进行抗原表位的预测，合成多肽抗原进行免疫筛选，集中选择特异性好，免疫原性高的表位，据此建立特异性的免疫和基因诊断。48人类第一次在还没有看到病毒、没办法分离、培养病毒、没有免疫学方法确认病毒的情况下，利用分子生物学技术，克隆了丙肝病毒，并进行测序及表达病毒抗原，发展了特异性的诊断试剂。这一成就，开创了反向基因工程学第一个成功的范例，有着巨大的实用价值和应用前景，是分子生物学和医学诊断学成功结合范例。49

HCV感染者血清中抗原含量极低，培养极为困难。HCV电镜图50学习要求：了解检测原理、方法和影响因素；掌握常用检验的参考值和临床意义，辩证地、全面的分析问题；注意实验的局限性。51第二章抗原抗体反应52抗原抗体反应：抗原和相应抗体间的特异性结合反应。既可发生在体内，也可发生在体外。体外发生的抗原抗体反应是我们开展免疫检测的物质基础。根据反应抗原的物理性状和反应的条件不同，抗原抗体反应可有不同的现象，如沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合、毒素中和等，这些现象就是我们免疫检验的检测信号和判断结果的依据。53抗原抗体反应的原理结合的部位：抗原表位和抗体超变区。结合的条件：二者之间紧密接触，结构互补、抗原抗体结合力的存在(静电引力、范登华引力、氢键结合力、疏水作用力)。

54静电引力（electrostaticforces）范德华引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氢键:最具特异性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗体结合力示意图一、抗原抗体结合力55抗原抗体的亲和性和亲和力亲和性(affinity)：抗体分子单一抗原结合部位(VH/VL)与一个相应抗原决定簇之间互补而存在的引力。亲和力(avidity)：抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关。亲和性和亲和力越高，抗原抗体结合速度越快，结合越牢固。56亲水胶体转化为疏水胶体未结合的抗原、抗体为亲水胶体，不会发生自然沉淀；结合后的抗原抗体复合物转化为疏水胶体，可形成较大块的沉淀物。可见反应抗原抗体复合物(疏水胶体)电解质抗原(亲水胶体)

抗体(亲水胶体)

+表面电荷减少，水化层变薄，失去亲水性能57第二节抗原抗体反应的特点特异性可逆性比例性阶段性58抗原抗体反应的特点1、特异性：抗原抗体结合的专一程度，由抗原表位和抗体超变区之间空间结构的互补吻合程度所决定。共同抗原与交叉反应不同抗原分子具有不同的表位，因此各具特异性。但有时相同或类似的表位也会出现在不同的抗原上，带有相同或类似表位的抗原互称共同抗原(commonantigen)。由某一共同抗原诱导产生的抗体，也可以与其共同抗原结合，这种现象称为交叉反应。在免疫检验中，交叉反应与检测的特异性密切相关，是引起假阳性结果的最主要的原因。59二、可逆性可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性，抗原抗体复合物的形成是结合和解离同时进行的动态过程。影响因素：抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合越牢固，越不易解离环境因素对复合物的影响－pH、离子强度

60前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalencezone)：

抗原抗体比例合适

抗原抗体反应比例性示意图比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，抗原抗体比例适合时才能形成大块的聚合物及肉眼可见反应。三、比例性614、阶段性第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见；第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。62影响抗原抗体反应的因素一、反应物自身因素1、抗原免疫反应性和特异性：免疫反应性好，结合速度快，结合牢固；特异性高，结合的专一程度也高。免疫反应性和特异性由抗原分子表位的性质和数目决定。理化因素：颗粒抗原形成凝集，可溶性抗原形成沉淀等。632、抗体来源：(1)多克隆抗体：来源于不同动物的多克隆抗体亲和力、等价带范围等均有差异，对免疫检测的准确性有直接影响。(2单克隆抗体：只针对同一位点的均一抗体，不适合用于沉淀和凝集反应。浓度：合适的浓度才能出现可见的反应结果。特异性与亲和力：决定抗原抗体结合的专一性、结合的速度和牢固程度。

64二、反应环境条件电解质：促进抗原-抗体复合物由亲水向疏水的转换。生理盐水或缓冲液酸碱度：抗原、抗体均是有生物活性的蛋白质，强酸强碱均能使蛋白质变性，降低抗原抗体的活性甚至使之失活。酸碱度:pH6～pH9温度：在一定范围内，提高温度能加速抗原抗体反应。温度:15℃～40℃，37℃最适65免疫学检测技术的类型沉淀反应；凝集反应；细胞溶解反应；中和反应；标记免疫的抗原抗体反应等。

分类的目的是便于我们能在免疫检测时识别免疫反应是否发生及发生的程度，来进行免疫检测结果的判断。

66衡量免疫检验水平的指标灵敏度特异性准确度精确度线性可以了解该方法的最高检测值和最低检测值，可确定该方法的检测范围，以防止含量过低或过高样品的检测误差。

稳定性简易性安全性价格67第三章免疫原和抗血清的制备68免疫诊断试剂：用于检测相应抗原、抗体或机体免疫状态的试验诊断制剂。免疫学检测：用已知抗原检测抗体，或用已知抗体检测抗原。免疫试剂主要的生物原材料是抗原和抗体。69天然抗体：未经明显自然感染或人工免疫而在体内产生的血清抗体(如针对ABO红细胞血型物质的抗体等)，多属IgM类。特异性抗体：抗原激发免疫细胞产生的抗体特异性抗体是免疫应答的重要产物，也是免疫检测中的试剂。人工制备抗体：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体。70多克隆抗体（polyclonalantibody，pAb)：抗原表位刺激机体多个B细胞克隆，产生针对抗原分子上一种或多种表位的抗体的混合物。免疫原：完全抗原，既能刺激机体产生免疫应答，也能与免疫应答产物特异性结合。71抗血清：含有针对特定抗原的多克隆定向抗体的动物血清。可来源于用免疫原免疫的动物血液，也可来源于病原微生物感染者的血液。多克隆抗体制备：1、免疫原免疫动物；2、抗血清的获取及多克隆定向抗体的纯化鉴定。72第一节免疫原的制备多克隆抗体的制备必须有高纯度的免疫原，否则无法获得特异、高效多克隆抗体。制备单克隆抗体对免疫原纯度的要求相对低。除人工模拟抗原外，含天然抗原的物质多数成份复杂，需要提取，纯化后方能作为免疫原应用。可作为免疫原的抗原：颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸73一、颗粒性抗原的制备细菌、病毒、细胞、寄生虫等。不同的颗粒抗原纯化方法不同，一般较为简单，如生理盐水洗涤、甲醛处理等。74二、可溶性抗原的制备和纯化蛋白质、细菌毒素都是良好的可溶性抗原1、组织细胞抗原的制备。材料新鲜低温保存，以防蛋白质变性；去除包膜、结缔组织、大血管，清洗灌注，剪成小块，粉碎(机械捣碎，研磨等)，低温离心取上清。752、培养细胞可溶性抗原的制备

组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化超声破碎法－超声波（1～20kHz）自溶法－自身酶系酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴76免疫球蛋白片段的制备：非共价键解离法－改变pH、利用强变性剂使肽链亚单位解离共价键解离法－氧化法和还原法，解离二硫键，使轻链和重链分开溴化氰裂解法，断开肽链酶解法－木瓜酶、胃蛋白酶

77超速离心法：差速离心法－低速和高速离心交替进行，分离大小差别较大的抗原密度梯度离心法－区带离心法分离具有不同沉降速度的物质（二）可溶性抗原的纯化78差速离心：低速离心和高速离心交替进行，逐步分级加大离心力，分步获取沉淀系数不同的物质。(两种物质粒子的沉降系数相差一个数量级(10倍)以上，用差速离心反复多次可达到良好的分离效果。按转速：普通(500-4000)、高速(8000-25000)、超速(25000-80000)、超高速(150000rpm)。蛋白质沉降系数在2-25之间，一般需要60000rpm以上才能分离。79

2、沉降平衡法：用于分离密度不同的物质。

密度梯度离心：离心时离心管中的介质是不均一的，从近中心到远中心密度不断增加形成梯度，分离物在离心力作用下，各自停留在与其密度相同的区域，分层收集，达到分离效果。常用的梯度介质有蔗糖、甘油、氯化銫等，最大密度各不相同。选用介质要注意浮力密度范围合适，被分离物质的密度不能大于介质的最大密度。80选择性沉淀法：核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素。组织细胞提取的抗原含有大量核酸，可用氯化锰等沉淀剂去除，也可用DNA和RNA酶将其降解。盐析法－硫酸铵、硫酸钠

有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜，暴露疏水性氨基酸残基，增加蛋白质上不同电荷引力，引起使蛋白质沉淀，尤其在等电点的条件下，沉淀更快速更完全。聚合物沉淀法－聚乙二醇

81(四)凝胶过滤

根据物质分子量大小进行分离。凝胶层析的支持介质由惰性的多孔颗粒组成。在层析过程中，被分离物质不仅随洗脱液均匀向下运动，而且无定向在颗粒小孔中扩散。大分子不能进入颗粒，只能沿颗粒间的空隙随洗脱液向下移动，较快到达底部并从柱中流出。小分子物质可以进入凝胶颗粒的孔隙内，在颗粒内及颗粒间扩散，从一个颗粒进入另一个颗粒，因此向下流动的速度慢。82(五)离子交换层析

离子交换剂以一种惰性物质为支持物，通过化学反应共价引入带电基团，可以静电吸附离子。以静电作用结合在离子交换剂上的离子称为平衡离子。蛋白质分子在偏等电点的pH值时可以带不同的电荷，因此可以置换离子交换剂上的平衡离子，和离子交换剂结合。不同蛋白质有不同的pI，在同一pH下，各种蛋白质所带的电荷种类和数量不同，因此置换平衡离子的能力不同。利用这个原理，可以将带有不同电荷的蛋白质分开。离子交换剂的支持物：树脂，纤维素和葡聚糖凝胶。83亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力(1)亲和层析支持物的选择：①非特异性吸附低；②液体流速快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结合；⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。最常用的支持物是Separose4B

84(2)配体的选择条件：配体指具有亲和力的双方，这里指抗原和抗体。①抗原或抗体必须单一特异性；②抗原与抗体必须具有较高的亲和力；③配体必须有一个适当的化学基团。85(3)抗原或抗体与支持物的结合：①活化支持物的功能基团：溴化氰；②接“手臂”：抗原或抗体与支持物结合86(4)亲和层析条件的选择：

①封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺过柱；②除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；解脱剂：3mol/L硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液87电泳法：

利用分子量和电荷量不同进行分离

88

蛋白质种类繁多性质各异，可采用的纯化方法也很多。无论何种方法，都是根据蛋白质以下几种性质设计的分离方法：1、溶解度不同；2、分子大小不同；3、带电荷的性质不同；4、物理吸附性不同；5、生物学亲和性不同。89蛋白质分离纯化的策略：了解纯化对象；明确纯化目的；调查所具备的实验条件；设计纯化方案。90（三）纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA91三、半抗原性免疫原的制备

半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质92常用载体：蛋白质缺点：载体本身也是免疫原，其分子量远远大于半抗原，因此刺激机体产生的抗体大部分为抗载体的抗体，抗半抗原的载体效价和纯度皆不理想。多肽聚合物(多抗原肽，MAP)常用多聚赖氨酸，多聚赖氨酸只起连结作用，本身没有免疫原性。采用MAP作为免疫原，较易获得高效价、高纯度的抗多肽半抗原的抗血清。

大分子聚合物

常用羟甲基纤维素等，可与半抗原结合，加入弗氏佐剂可诱导动物产生良好的抗体。93①物理方法：通过电荷和微孔吸附半抗原吸附的载体有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等

（二）半抗原与载体的连接方法②化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法戊二醛法混和酸酐法过碘酸氧化法不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与载体连接

94（三）半抗原性免疫原的鉴定一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子，才能刺激产生抗体。测定半抗原与载体比例的方法：1.吸收光谱分析法2.放射性核素标记半抗原渗入法95第二节免疫佐剂免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。96第二节免疫佐剂一、佐剂的种类化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂等生物制剂:如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌细胞因子等。用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、polyI∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)97二、佐剂的生物学作用增强免疫原性：使免疫原性弱的物质变为强免疫原；增加抗体的滴度：包括初次和再次免疫应答的抗体滴度；改变抗体类型：可由产生IgM转变为IgG，或由IgG转变为IgE等其它类型抗体。98三、佐剂增强免疫应答的机制1.改变抗原物理形状，使抗原在体内滞留或缓慢释放，延长抗原与免疫细胞作用的时间，增强抗原免疫原性；2.抗原经佐剂作用后，易被巨噬细胞吞噬、加工处理；3.刺激单核/巨噬细胞活化，释放细胞因子；4.刺激淋巴细胞增生分化。99第三节抗血清的制备

抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体目的：获取高质量的多克隆特异性抗体。需要高质量的免疫原，合适的动物和有效的免疫方案。100抗原来源与动物种属的关系

种属差异越远，免疫原性越强

动物个体的选择

适龄、健康、体重符合要求

抗原的性质不同性质的免疫原，适用的动物有所不同一、免疫动物的选择101二、免疫方法和途径抗原剂量：在一定范围内，抗原量与免疫强度成正相关。抗原量过大或过小均易产生免疫耐受。注射途径：抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。常用的注射途径及对抗原的吸收速度：静脉=脾脏=淋巴结＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内。102免疫间隔时间：根据免疫原的强弱，代谢情况等决定。一般情况下，第一次加强免疫应在基础免疫后的2-3周，以后每7-10天加强一次。加强免疫的次数：应检测血清中的抗体滴度，决定加强免疫的次数。103免疫动物血清中的抗体滴度合格后即可放血。颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊

心脏采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、鸡

静脉采血法：

家兔、山羊、绵羊

血液自然凝固后离心，采集血清。三、动物采血法104抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验、双向免疫扩散试验、ELISA抗体纯度的鉴定：SDS、双向免疫扩散试验、免疫电泳抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验

一、抗血清的鉴定105第四节抗血清的鉴定和保存一、抗血清的鉴定鉴定的目的：确定有无目的抗体的存在，含量高低。亲和力如何。主要鉴定指标：效价、特异性、抗体纯度、抗体亲合力等。鉴定方法：单扩、双扩、ELISA等。二、抗血清的保存2℃～8℃保存：短期保存冰冻保存：保存5年真空干燥保存：保存5～10年反复冻溶会严重影响抗体的活性。106第五节抗血清的纯化

抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂质干扰试验结果。

107盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法凝胶过滤法：常结合盐析法离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose4B制成亲和层析柱

一、特异性IgG抗体108单价特异性是指血清只与其特异性抗原发生反应。亲和层析法：杂抗原交联Sepharose4B柱吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗原混合液制成固相吸附剂，吸附抗血清中的杂抗体二、单价特异性抗血清109

第四章

单克隆抗体和基因工程抗体的制备1101975年Kohler和Milstein成功地将绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备出小鼠抗绵羊红细胞的单克隆抗体。单克隆抗体在医学生物学的各个领域有着广泛的用途。免疫检验由于单克隆抗体的出现，取得了巨大的进展。

111单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）：借助B细胞杂交瘤技术，由单个B细胞增殖而成的细胞克隆所产生的、高度均一的、单一特异性的抗体。

单克隆抗体的特点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无、易于制备。112单克隆抗体制备的基本原理

致敏的B淋巴细胞能分泌特异性抗体，但不能在体外长期存活。骨髓瘤细胞可以在体外大量繁殖，但不能分泌特异性抗体。将小鼠的骨髓瘤细胞和能分泌抗体的B淋巴细胞融合，则融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌抗体的能力。由于每个致敏的B淋巴细胞只针对单一的抗原表位产生抗体，所以克隆化的杂交瘤细胞能够分泌针对单一表位的单克隆抗体。113一、B淋巴细胞杂交瘤技术(一)细胞的选择和融合制备B淋巴细胞杂交瘤的目的是生产特异性的单克隆抗体。融合细胞的一方必须是能产生抗体的B淋巴细胞，通常来源于免疫小鼠的脾细胞。融合细胞的另一方是为了保持细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才有这种特性，同时这种细胞本身不分泌免疫球蛋白。选择同一体系的细胞能增强融合的成功率。骨髓瘤是B淋巴细胞系的恶性肿瘤，是脾细胞最理想的融合对象。细胞融合的方法多采用化学试剂助融，最常用的细胞融合剂为PEG。114(二)选择培养基的应用在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合液中，细胞融合是随机的。可能出现的细胞形式：融合的脾细胞和瘤细胞，融合的瘤细胞和瘤细胞，融合的脾细胞和脾细胞，未融合的脾细胞，未融合的瘤细胞，细胞的多聚体。融合及未融合的脾细胞体外不能长期存活，细胞的多聚体也容易死亡。融合和未融合的瘤细胞则需筛选去除。

115选择性培养基：只有杂交瘤细胞才能生长。HAT选择性培养基的原理：骨髓瘤细胞为HGPRT缺陷株，或TK缺陷株。HGPRT和TK是细胞合成DNA和RNA旁路途径上两种重要的酶，如果缺乏其中任何一种，在正常合成途径受阻的情况下，细胞将不能利用旁路途径而死亡。HAT的A为氨甲喋呤，是一种正常途径的阻断剂，H和T分别为次黄嘌呤和胸腺嘧啶，它们分别是HGPRT和TK的底物，具备HGPRT和TK的细胞在正常途径受阻时，可利用H和T依靠旁路途径合成DNA和RNA继续生存。在杂交瘤的制备中，致敏的B淋巴细胞含有HGPRT和TK，可弥补骨髓瘤细胞缺陷，因此只有杂交的细胞能在HAT选择性培养基中长期存活，其余未杂交的细胞都将死亡。116流程一、杂交瘤技术117(三)有限稀释与抗原特异性选择克隆化：一种抗原有多个表位，一个B细胞只分泌针对一个表位的抗体。一个动物在受到抗原刺激后的体液免疫应答，是众多B细胞克隆针对不同表位的抗体分泌，针对目的抗原表位的B细胞只是少数。所以并非所有的杂交细胞都能分泌针对目的表位的特异性抗体，需要进行用单细胞分离培养的方法进行筛选。118筛选过程：融合细胞的克隆化：将融合细胞充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数理论上为一个。细胞培养至覆盖10%-20%孔底时，吸取培养上清检测抗体分泌情况，筛选出高抗体分泌孔。将高抗体分泌孔中的细胞再克隆化，ELISA再次鉴定，选出高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

119防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义120配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏121三、阳性杂交细胞的克隆化培养杂交瘤形成的初期很不稳定，在最初几天染色体容易丢失。杂交瘤细胞丢失了目的抗体表达的基因，仍能生长繁殖。必须将阳性杂交瘤细胞进行多次的单细胞分离培养，以确保单克隆抗体的纯一性